Papel de factores de la transcripción y la replicación del ADN en el origen de la inestabilidad genómica

• Autores: Juan Francisco Lafuente Barquero
• Directores de la Tesis: Andrés Aguilera López (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2017
• Idioma: español
• Número de páginas: 194
• Tribunal Calificador de la Tesis: Germán Larriba Calle (presid.), Sonia Jimeno González (secret.), Rodrigo Bermejo Moreno (voc.), Juan Jiménez Martínez (voc.), Iván Valle Rosado (voc.)
• Materias:
  • Ciencias de la vida
    • Genética
    • Biología molecular
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: Idus
• Resumen

  • Mantener la integridad del genoma no es tarea fácil para las células. El ADN sufre constantes ataques de agentes químicos y/o físicos de origen exógeno y endógeno, pero no sólo eso, los propios procesos celulares que emplean el ADN como sustrato también pueden generar daños y roturas. Dos de los procesos más fundamentales para la supervivencia de la célula, la replicación y la transcripción, son a su vez de las fuentes más importantes de daños en el ADN, especialmente en los casos de colisiones entre las maquinarias responsables de ambos procesos. Las colisiones entre transcripción y replicación pueden darse por diversos motivos, como la acumulación de estrés torsional en el ADN, la competencia entre polimerasas por el ADN molde en regiones del genoma con alta tasa de transcripción, o la presencia de secuencias específicas de ADN con tendencia a formar estructuras diferentes a su conformación B canónica. Dentro de esta última clasificación existe un tipo de estructura nucléica que está adquiriendo una creciente relevancia, los bucles R (más conocidos como R-loops). De origen primordialmente co-transcripcional, los R-loops están constituidos por una cadena sencilla de ADN desplazada y un híbrido de ARN:ADN formado entre el ARN y su hebra de ADN molde. Los híbridos de ARN:ADN son estructuras naturales, que presentan mayor estabilidad que la propia doble hélice de ADN, y que participan en diversos procesos celulares, como la replicación del ADN mitocondrial o el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas. Sin embargo, la presencia de una cadena sencilla de ADN desplazada, característica de los R-loops, o la capacidad de estos de interferir con la replicación, pueden suponer riesgos para el mantenimiento de la estabilidad de los genomas. La presente tesis se plantea con la meta de avanzar en el conocimiento sobre los mecanismos que dan lugar a la formación y acumulación de los R-loops, y la de descubrir nuevos factores implicados en el mantenimiento de su homeostasis para evitar la aparición de conflictos entre la transcripción y la replicación y la inestabilidad genética que va asociada a ellos. Adicionalmente, empleando el organismo modelo S. cerevisiae, investigamos el funcionamiento de la proteína humana RECQL5, que a día de hoy se considera uno de los factores con el papel más claro y directo en la coordinación de los procesos de transcripción y replicación del ADN. Nuestros resultados apoyan la creciente noción de que la presencia de R-loops en las células es más común de lo que se pensaba inicialmente, incluso en fondos genéticos silvestres. Mediante análisis de secuenciación masiva y estudios bioinformáticos hemos encontrado que los telómeros, el ADN ribosómico (rDNA), los transposones y numerosos genes transcritos por la RNAPII son regiones con enriquecimiento de híbridos de ARN:ADN en una estirpe silvestre, patrón que se mantiene con cierta constancia en mutantes hpr1Δ. Los mutantes en este componente del complejo THO de elongación de la transcripción muestran fenotipos de acumulación de R-loops, hiperrecombinación e inestabilidad genética asociada a la transcripción. Nuestro trabajo sugiere que la diferencia puede no residir en la cantidad de híbridos que se formen en el fondo mutante, si no en ciertas características que diferencien estos R-loops de los presentes en cepas silvestres. Sin embargo, mejoras en la metodología deben ser introducidas antes de poder arrojar conclusiones más definitivas.

    Paralelamente hemos investigado cómo se originan los R-loops. Actualmente se considera que esencialmente son estructuras formadas durante la trascripción. No obstante, no se puede descartar la posibilidad de que un transcrito pudiera hibridar con otras regiones homólogas del genoma, generando R-loops en trans. Nuestros resultados no muestran ningún indicio de que la formación de R-loops no co-transcripcionales sea independiente de la transcripción, o que su formación tenga un impacto detectable en recombinación. Otros datos que rechazan la hipótesis de que Rad51 tenga un papel activo en la formación de R-loops en el mutante hpr1Δ. Una búsqueda de nuevos factores implicados en la homeostasis de R-loops nos llevó hasta la helicasa de ADN Mph1, FANCM en humanos. Los mutantes de levadura deficientes para esta proteína o su actividad helicasa acumulaban híbridos de ARN:ADN. A pesar de esto, las células mph1Δ no mostraron fenotipos de hiperrecombinación, ni defectos replicativos, ni interacciones genéticas con hpr1 o sen1. Serán necesarios estudios futuros para dilucidar si el papel de Mph1 en la eliminación de R-loops es directo o indirecto.

    Finalmente, hemos demostrado que la helicasa RECQL5 humana puede expresarse en levaduras, donde interacciona con proteínas ortólogas de aquellas humanas con las que se asocia de forma natural, como RNAPII o Rad51. Sin embargo, no hemos podido relacionar la inestabilidad genómica que observamos al expresar RECQL5 en levaduras con defectos producidos en la transcripción o en la replicación. No obstante, describimos por primera vez una relación funcional entre RECQL5 y la helicasa Srs2 de la levadura, que aporta nuevas vías para comprender el funcionamiento de ambas proteínas y sus papeles en el mantenimiento de la estabilidad genómica.