Ayuda
Ir al contenido

Dialnet


Isocitrato deshidrogenasa de cianobacterias: Purificación, caracterización y clonación del Gen icd

  • Autores: M. Isabel Muro Pastor
  • Directores de la Tesis: Francisco Javier Florencio Bellido (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 1993
  • Idioma: español
  • Número de páginas: 163
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: Idus
  • Resumen
    • El presente trabajo se ha centrado en el estudio de la isocitrato deshidrogenasa de cianobacterias, con objeto de contribuir al conocimiento de las enzimas del metabolismo del carbono en estos organismos y concretamente de la enzima que aporta al esqueleto carbonado para la asimilación del amonio. La IDH representa la conexión de las rutas metabólicas del carbono y el nitrógeno.

      Se han elegido dos cianobacterias para realizar este estudio: Synechocystis sp. PCC 6803b (abreviaremos en adelante como Synechocystis 6803) y Anabaena sp. PCC 7120 (Anabaena 7120).

      Synechocystis 6803 es una bacteria unicelular encuadrada en la sección taxonómica I, que puede crecer fotoautotróficamente sin requerimientos orgánicos (Rippka et al., 1979) y también en condiciones mixotróficas y heterotróficas (Anderson y McIntosh, 1991).

      Como otras cianobacterias Synechocystis 6803 es altamente poliploide y posee en torno a doce copias cromosómicas por célula (Labarre et al, 1989). Su natural capacidad para ser transformada con ADNforáneo (Grigorieva y Shestakov 1982) y mutada de forma dirigida (Williams, 1988) la hacen una de las cianobacterias más utilizadas para los estudios genéticos y de Biología Molecular.

      Este organismo ha sido objeto además de varios estudios relacionados con el metabolismo del nitrógeno y más concretamente con la ruta GS-GOGAT, por lo que parecía adecuado para los objetivos que nos proponíamos en este trabajo.

      Por otra parte Anabaena 7120 es una cianobacteria filamentosa fijadora de dinitrógeno y formadora de heterocistos perteneciente a la sección IV de la clasificación de Rippka et al., siendo un organismos fotoautrófico estricto.

      La transferencia de ADN foráneo a esta estirpe, al igual que al resto de las cianobacterias filamentosas en las que este proceso se ha llevado a cabo, se realiza mediante un sistema de conjugación interespecífica desde E. coli a la cianobacteria (Wolk et al., 19849 y el desarrollo de este procedimiento ha permitido en los últimos años un gran avance de los estudios genéticos y de Biología Molecular de las cianobacterias filamentosas.

      La generación de mutantes en Anabaena se ve dificultada al igual que en Synechocystis por la poliploidía ya que se requieren largos periodos de segregación hasta obtener la homogeneidad de todos los cromosomas de una misma célula.

      Se ha elegido esta estirpe como modelo de cianobacteria filamentosa fijadora de dinitrógeno, que permitiera estudiar el posible papel de la IDH como donadora de poder reductor para la nitrogenasa durante el proceso de fijación de dinitrógeno.

      Se describe a continuación la purificación y caracterización de las NADP-IDHs de estas dos cianobacterias así como la clonación y análisis de los genes icd que codifican para estas enzimas.se ha realizado asimismo la mutagénesis dirigida de los correspondientes genes icd en ambas cianobacterias.

      CONCLUSIONES 1. Se ha purificado hasta homogeneidad electroforética una enzima con actividad isocitrato deshidrogenasa, presente en la cianobacteria unicelular, heterótrofa facultativa Synechocystis sp. PCC 6803 y en la filamentosa fijadora de dinitrógeno, formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120.

      2. La isocitrato deshidrogenasa de las dosis cianobacterias estudias es una enzima dimérica, estrictamente dependiente de NADP y de cationes divalentes como el Mg2+ o el Mn2+ para su actividad. Según sus características fisicoquímica y cinéticas, las NADP-IDHs de Synechocystis 6803 y Anabaena 7120 son muy similares entre sí y a su vez a las NADP-isocitrato deshidrogenasas de diferentes fuentes.

      3. Se ha clonado y secuenciando el gen icd que codifica la NADP-IDH de Anabaena 7120, así como una gran parte del gen icd de Synechocystis 6803. El gen icd de Anabaena es capaz de expresare en E. coli y la enzima por el codificada complementa la auxotrofía de glutamato característica de los mutantes IDH- de este organismo.

      4. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes icd de Synechocystis 6803 y Anabaena 7120 son muy similares entre sí y presentan así mismo similitud con otras secuencias de isocitrato deshidrogenasas e isopropilmalato deshidrogenasas. Dicha similitud es especialmente alta con la secuencia deducida para la NADP-IDH de E. coli, si bien existe una zona específica de 44 aminoácidos en las secuencias cianobacterianas, no alineable con ninguna de las demás secuencias disponibles.

      5. Los niveles de actividad NADP-IDH de Synechocystis 6803 y Anabaena 7120 se encuentran regulados en función de la fuente de nitrógeno empleada para su cultivo o de la disponibilidad de la misma. La actividad IDH de Synechocystis se incrementa entre 4 y 5 veces en células sometidas a hambre de nitrógeno. En Anabaena dicha actividad es superior cuando este organismo se cultiva en ausencia de nitrógeno combinado.

      6. La regulación de la actividad NADP-IDH de Synechocystis 6803 por hambre de nitrógeno se corresponde con un incremento de la cantidad de proteína NADP-IDH así como de ARNm del gen icd en dichas condiciones. Dicha regulación parece producirse por tanto a nivel transcripcional y sugiere una coordinación entre el metabolismo del nitrógeno y del carbono.

      7. Se han obtenido estirpes mutantes de Anabaena 7120 y Synechocystis 6803 que presentan inactivado el gen icd en parte de sus copias cromosómicas. La mutación de dicho gen en todos los cromosomas de estas cianobacterias y por tanto la obtención de estirpes totalmente carentes de actividad IDH no se ha conseguido en las condiciones probadas. Consideramos que el gen icd es esencial para el crecimiento de las cianobacterias estudiadas.


Fundación Dialnet

Dialnet Plus

  • Más información sobre Dialnet Plus

Opciones de compartir

Opciones de entorno