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Efectos de la calidad espermática del ciervo de la exposición a plomo y otros metales pesados: aplicación de modelos de exposición in vitro con espermatozoides

  • Autores: Maria del Pilar Castellanos Expósito
  • Directores de la Tesis: Rafael Mateo Soria (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Castilla-La Mancha ( España ) en 2014
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Antonio Juan García Fernández (presid.), Ana Josefa Soler Valls (secret.), Julián Santiago Moreno (voc.)
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: RUIdeRA
  • Resumen
    • INTRODUCCIÓN El plomo (Pb) uno de los tóxicos ambientales e industriales más difundidos en el planeta debido al uso con muy variados fines que se ha hecho de este metal por diferentes civilizaciones a lo largo de la historia, lo que explica la intensa actividad de extracción minera de Pb que se ha tenido que asegurar cantidades suficientes de este metal. En lo que a nuestro país se refiere, la comarca minera del Valle de Alcudia y Sierra Madrona durante los siglos XX y XX se encontraba a la cabeza de producción de este metal con 130.000 toneladas métricas anuales (Pérez de Percebal Verde y Sánchez-Picón, 2001). Las consecuencias negativas sobre el medio ambiente en esta zona persisten en la actualidad con niveles medios de Pb de 15.175 mg/kg en escombreras, 2.209 mg/kg en suelos circundantes y 1.785 mg/kg en los sedimentos de los cursos de agua próximos (Higueras et al., 2011) muy por encima de los valores medios registrados en Europa. Además de este impacto ambiental, esta situación provoca una grave riesgo para la fauna silvestre de la zona, por transferencia de metales a la cadena trófica a través de los vegetales y que son finalmente ingeridos por los herbívoros silvestres y domésticos (Reglero et al., 2008; Rodríguez-Estival 2012). Estudios anteriores en estas zonas mineras comparadas con zonas control han mostrado una mayor concentración de Pb en el hígado de ungulados como el ciervo rojo (Cervus elaphus) y el jabalí (Sus scrofa) (Reglero et al., 2008) con clara relación entre las cantidades de Pb en sedimentos, suelo y en plantas. Incluso en el hueso de estos animales, la concentración de Pb fue más elevada que en el hígado (Reglero et al., 2009a), lo que muestra el efecto crónico de la contaminación por metales aunque la concentración hepática de Pb en ciervos de Valle de Alcudia y Sierra Madrona está muy por debajo de la asociada con signos clínicos de envenenamiento por Pb (30 ¿g/g p.s o 10 ¿g/g en p.f., Ma, 2011; Frøslie et al., 2001). Sin embargo, el descenso en los niveles de antioxidantes exógenos como las vitaminas A y E que se han encontrado en estos tejidos, reflejan una alteración en el balance prooxidantes-antioxidantes producido por la exposición a este metal (Rodriguez-Estival et al., 2011) unido también a un descenso en los niveles de los ácido graso poliinsaturados (PUFAs) especialmente vulnerables al ataque oxidativo (Reglero et al., 2009a). Por otra parte, se conoce el efecto negativo del Pb y otros metales sobre la calidad del espermatozoide en mamíferos (Marzec-Wróblewska et al., 2012) y la relación que guarda la presencia de este metal en sangre o semen con la infertilidad masculina (Li et al., 2012) como consecuencia de un nº escaso de espermatozoides, espermatozoides con poca motilidad o por azoospermia (ausencia de espermatozoides). Por otra parte, este efecto también se ha evidenciado en estudios in vitro (Ghaffari y Motlagh, 2011).

      El efecto tóxico del Pb para la función reproductora tiene un carácter multifactorial al actuar a diferentes niveles. El riesgo de exposición al Pb se inicia ya durante el desarrollo embrionario por la interacción del mismo con la barrera placentaria (Caserta et al., 2013) produciendo trastornos endocrinos que se manifiestan desde las primeras etapas del desarrollo, y que pueden ocasionar la maduración reproductiva retardada por alteración del proceso de espermatogénesis (Sant¿Ana et al., 2001). Tras la espermatogénesis la toxicidad del Pb puede seguir actuando sobre los procesos post-testiculares de maduración y capacitación del espermatozoide afectando a procesos como la hipermotilidad que ha de adquirir la célula, como la reacción del acrosoma en la que se liberan las enzimas necesarias para la fertilización del óvulo. En estos procesos se producen cambios en la estructura y fisiología de la membrana del espermatozoide que además de ser calcio-dependientes, regulan la concentración de este ión a nivel intracelular (Lishko et al., 2010; Visconti et al., 2011). El efecto tóxico que ejerce el Pb a este nivel puede deberse, por una parte, a la conocida competencia del Pb2+ con el ion calcio (Ca2+), que le lleva a interferir con él en muchos mecanismos fisiológicos controlados por el mismo (Chen et al., 2009), y por otra parte, a los cambios en la permeabilidad en la membrana del espermatozoide muy rica en ácidos grasos poliinsaturados fácilmente oxidables (Del Barco-Trillo y Roldán 2013). Por otro lado cuando los espermatozoides aún inmaduros se desplazan por el fluido producido por los túbulos seminíferos hacia el tortuoso conducto del epidídimo, la presencia de tóxicos ambientales como el Pb pueden provocar un aumento de especies reactivas del oxígeno (ERO) que alteran el sistema de antioxidantes naturales endógenos presente en el plasma seminal (O¿Flaherty et al., 1997; Potts et al., 2000). Esta situación de estrés oxidativo pueden provocar tanto daños en las bases nucleotídicas del ADN, como desencadenar la peroxidación de los lípidos de las membranas o llevan a alterar la homeostasis del Ca2+ y de los grupos sulfidrilos de las proteínas (Valko et al., 2005).

      OBJETIVOS: ¿ Valorar los factores que han determinado la disminución de la calidad espermática en ciervo común de áreas mineras.

      ¿ Hacer un diseño experimental para analizar los efectos directos del Pb con niveles umbral en los procesos post-testiculares.

      CONTENIDO 1. Reducción de la calidad espermática en relación con el estrés oxidativo en ciervo común de un área minera Se han estudiado los efectos de la elevada absorción de metales pesados en la calidad del esperma de ciervo común de áreas mineras, así como en los mecanismos antioxidantes en espermatozoides y testículo de estos animales. Se analizaron las concentraciones de Pb, Zn, Cu, Cd, As y Se en un total de 21 animales de áreas mineras y 20 de áreas control y se pesaron y midieron los testículos. Se valoró la motilidad, la integridad del acrosoma y la viabilidad y funcionalidad de la membrana en los espermatozoides epididimarios. También se midieron los niveles de peroxidación lipídica (TBARS), el glutatión total y oxidado (tGSH) y la actividad de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx) y superóxido dismutasa (SOD) en testículos y espermatozoides. Los ciervos de zonas mineras mostraron menos concentración de Cu en el testículo, una mayor masa y tamaño del testículo y una reducción de la viabilidad e integridad del acrosoma del espermatozoide. Por último, estos efectos sobre la calidad espermática se asociaron con una disminución del Cu y un aumento de Se en los testículos y con una disminución en la actividad de SOD y GPX tanto en los testículos como en los espermatozoides. 2. Cambios en la composición de ácidos grasos en testículo y espermatozoide de ciervo común expuesto a contaminación por metales En este estudio se analizó el perfil de ácidos grasos de espermatozoides y testículos en 29 animales de áreas mineras y se compararon con 33 animales de áreas control. En los ciervos de las áreas mineras, a pesar de la elevada cantidad de Pb en el hígado y en el hueso, las concentraciones de este metal en los espermatozoides y en el testículo no fueron significativamente más elevadas en relación a los animales de las zonas control, pero si se han encontrado diferencias en los niveles de Cu en el testículo que fueron más bajos en los animales de la zona minera. Además en el testículo de animales de estas áreas, ha habido un aumento en el porcentaje de ácido linoleico (18:2n-6) y dihomo-gamma- linolénico (20:3n-6) y una disminución del porcentaje del ácido araquidónico (20:4n-6); y el porcentaje de este último también fue más bajo en los espermatozoides de los ciervos de zonas mineras. Los niveles de Cu en testículo estuvieron positivamente correlacionados con el porcentaje de ácido araquidónico. Por ello, se piensa que la alteración de la homeostasis del Cu causada por la contaminación por metales puede estar detrás de los efectos observados en los espermatozoides de ciervos de estas áreas.

      3. Incremento de fragmentación de la cromatina y reducción de la integridad del acrosoma en espermatozoide de ciervo común expuesto a contaminación por plomo En este estudio se analizó en ciervos comunes (Cervus elaphus) de áreas mineras (n=37) y áreas control (n= 26), los niveles de plomo (Pb) en los espermatozoides y testículo, los daños en la cromatina así como la actividad de antioxidantes endógenos, como la glutatión peroxidasa (GPX) en los espermatozoides para analizar los efectos de este metal. Los ciervos de la zona contaminada por Pb presentaron mayores niveles de este metal tanto en el parénquima y la cola del epidídimo, como en los espermatozoides junto a un porcentaje inferior de espermatozoides con acrosoma intacto. También hubo un aumento en la actividad de la glutatión peroxidasa y en los índices de fragmentación de la cromatina (XDFi) y de cromatina inmadura o anormalmente condensada (HDS) en los ciervos de áreas mineras. Estos datos muestran que la contaminación en las zonas mineras puede producir en la fauna silvestre daños en la cromatina y en la membrana de los espermatozoides. 4. Identificación de la concentración y tiempo de incubación óptimos para el estudio in vitro de los efectos del plomo en el espermatozoide de morueco (Ovis aries) Se estudiaron los efectos del plomo (Pb) in vitro sobre los espermatozoides de morueco (Ovis aries) con la finalidad de establecer un nivel umbral que afecte a la función espermática. Para ello se incubaron los espermatozoides durante diferentes tiempos entre 15 y 180 minutos y con distintas concentraciones de plomo en un rango entre 0 y 5000 ng/ml Pb2+. Tanto la presencia de plomo como el tiempo de incubación afectaron negativamente a la motilidad, la integridad del acrosoma, la funcionalidad de la membrana y la viabilidad del espermatozoide. La integridad del acrosoma ha estado linealmente afectada por ambos factores, siendo a los 30 minutos de incubación y con 50 ng/ml de Pb2+, el tiempo y concentración de Pb más bajos a los que se ha producido este efecto. De esta forma, se vio que estos valores de concentración y tiempo de incubación pueden representar unas condiciones experimentales apropiadas para los estudios in vitro de los mecanismos de acción del plomo sobre los espermatozoides.

      5. Efectos del plomo in vitro en la composición de ácidos grasos, biomarcadores de estrés oxidativo y calidad del espermatozoide de morueco.

      Se evaluó el efecto del plomo sobre la calidad espermática y sobre varios parámetros asociados con el estrés oxidativo en suspensiones de espermatozoides de morueco (Ovis aries) incubadas con 0, 50 o 500 ng/ml de Pb2+ durante 0, 1, 3 y 6 horas. La presencia de Pb en el medio de incubación redujo la integridad del acrosoma y la motilidad de los espermatozoides así como la funcionalidad y la integridad de su membrana. Sin embargo, el porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) y la actividad de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx) y superóxido dismutasa (SOD) no se vieron afectados por la presencia de plomo si bien la actividad de la GPx descendió y la composición total de ácidos grasos cambió al aumentar la proporción relativa de ácido esteárico (18:0) durante el tiempo de incubación pero de forma independiente a la presencia de plomo. Los datos muestran efectos similares del plomo in vitro sobre la calidad espermática a los observados in vivo, pero en este caso sin guardar relación con los biomarcadores de estrés oxidativo. 6. Efectos de inhibidores de la capacitación sobre los cambios inducidos por plomo en espermatozoide de morueco En este estudio, los espermatozoides eyaculados de seis moruecos (Ovies aries) se incubaron in vitro con o sin 50 ng Pb2+/ml durante 30 minutos y con o sin tres diferentes moduladores potenciales de los efectos del Pb2+ en los espermatozoides: charidobtoxina, quinacrina y estaurosporina. Las muestras incubadas con Pb2+ mostraron reducciones significativas en la integridad del acrosoma y en la viabilidad de los espermatozoides. Pro ninguno de los tres inhibidores estudiados ha tenido un efecto protector contra el Pb2+. Por el contrario, los espermatozoides incubados con plomo tuvieron una menor integridad de acrosoma cuando éstos se incubaron con estaurosporina e igualmente la viabilidad de los espermatozoides fue inferior cuando se incubaron con charidobtoxina. La quinacrina fue la única sustancia capaz de aumentar la concentración de Pb2+ en los espermatozoides, por lo tanto los efectos del Pb2+ por el tratamiento con estaurosporina y charidobtoxina no se deben al aumento en la captación de Pb2+ por los espermatozoides.

      CONCLUSIÓN 1. La contaminación residual por minería de en el Valle de Alcudia y Sierra Madrona provoca en el ciervo común la acumulación de Pb en testículo y espermatozoides.

      2. La viabilidad de la membrana y la integridad del acrosoma, que comprometen ambas la capacidad fecundante del espermatozoide de los ciervos, han sido los parámetros más afectados.

      3. La disminución de la viabilidad de la membrana y la integridad del acrosoma de los espermatozoides de ciervos ha estado relacionada con el descenso en la actividad antioxidante de la SOD y la GPX en testículo y con alteraciones en la homeostasis de elementos como Cu y Se (cofactores enzimáticos).

      4. Los ciervos de la zona minera con menor calidad espermática han presentado una mayor actividad de la GPX en espermatozoides, que puede indicar un intento proteger al espermatozoide del daño oxidativo producido por la contaminación minera.

      5. La exposición a la contaminación minera ha inducido cambios en el perfil de ácidos grasos de espermatozoides y testículo de los ciervos, siendo más notable la disminución del ácido araquidónico que tiene un importante papel en el proceso de capacitación del espermatozoide.

      6. La acumulación de Pb en ciervos debido a la contaminación minera se relaciona con un aumento en el índice de fragmentación del ADN, que a su vez se asocia con disminución de la calidad espermática.

      7. El efecto del Pb sobre la viabilidad espermática y la integridad del acrosoma del espermatozoide en etapas post-testiculares se ha reproducido in vitro con semen de morueco tratado con 50 ng/ml Pb2+. 8. La exposición in vitro al Pb de los espermatozoides produce una disminución de la calidad espermática, pero sin relación con biomarcadores de estrés oxidativo o con cambios significativos en la composición de ácidos grasos de la membrana espermática.

      9. El tratamiento in vitro de semen de morueco con moduladores de funciones Ca-dependientes de los espermatozoides, como charidobtoxina, estaurosporina o quinacrina, no han reducido el efecto del Pb en la viabilidad de membrana o la integridad del acrosoma, y por el contrario en el caso de la quinacrina lo puede llegar a agravar al aumentar la entrada de Pb al interior del espermatozoide.

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