Inestabilidad genética asociada a transcripción
- Autores: Belén Gómez González
- Directores de la Tesis: Andrés Aguilera López (dir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2009
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Josep Casadesús Pursals (presid.), Martí Aldea Malo (secret.), Charles White (voc.), Almudena Rodríguez Ramiro (voc.), Carlo Vito Bruschi (voc.)
- Materias:
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- Resumen
Durante el metabolismo del ADN tienen lugar diversos procesos, como son la replicación, transcripción o la reparación. Dada la simultaneidad de los mismos, se requiere una alta coordinación para preservar la integridad de la información genética y evitar la inestabilidad de los genomas. La inestabilidad genética se asocia frecuentemente a determinados tipos de enfermedades genéticas y muchos de los genes involucrados en el mantenimiento de la estabilidad genética actúan como supresores de la formación de tumores. No obstante, la inestabilidad genética también es crucial en la evolución de los organismos ya que constituye una fuente de variabilidad genética. Además, juega un papel muy importante en procesos esenciales en el desarrollo como son las reordenaciones de los genes de las inmunoglobulinas (Maizels, 2005).
Dentro del término inestabilidad genética se incluyen todas las alteraciones genéticas, desde mutaciones puntuales a reorganizaciones cromosómicas. Entre los factores que influyen en el mantenimiento de la estabilidad genética podemos distinguir aquellos que actúan en trans o en cis. Es decir, existen procesos como la replicación o la reparación cuyos errores pueden generar inestabilidad genética, o los mecanismos de control (checkpoints) que previenen la acumulación de dichos fallos durante todo el ciclo celular. Por otra parte, existen lugares en el genoma que poseen una especial propensión a la inestabilidad, como son los llamados sitios frágiles o las secuencias que se transcriben mucho.
Así, la transcripción del ADN está entre los factores que pueden originar la inestabilidad genética. Podemos encontrar un ejemplo de inestabilidad genética asociada a transcripción en procesos naturales como la diversificación de los genes que codifican para los anticuerpos en eucariotas superiores. La transcripción de secuencias específicas es esencial para que tengan lugar la recombinación específica de sitio V(D)J, y posteriormente, la recombinación de cambio de clase (CSR) y la hipermutación somática (SHM) . En estos dos últimos procesos interviene la proteína AID (Activation-Induced cytidine Deaminase) (Muramatsu et al., 2000; Okazaki et al., 2002; Revy et al., 2000) (revisado en (Di Noia and Neuberger, 2007)). Aunque esta enzima fue inicialmente identificada por su similitud con Apobec-1, que actúa sobre el ARN, existen bastantes evidencias a favor de que AID actúa directamente sobre el ADN de las regiones S y V para iniciar los procesos de CSR y SHM, respectivamente (Petersen-Mahrt et al., 2002). La especificidad de acción de AID parece depender de que el ADN se encuentre en forma de cadena sencilla, como ocurre cuando se transcribe (Bransteitter et al., 2003; Chaudhuri et al., 2003; Sohail et al., 2003). En este sentido se ha descrito la formación de un híbrido ADN-ARN en dichas regiones S, lo que genera la formación de cadena sencilla en la cadena no transcrita del ADN (Daniels and Lieber, 1995; Reaban et al., 1994; Yu et al., 2003). Dicha cadena sencilla puede además estabilizarse por la formación de estructuras llamadas G-quartets debido al alto contenido en GC de las regiones S (Dempsey et al., 1999; Duquette et al., 2004). Así, parece que la transcripción puede intervenir en la especificidad de acción de AID mediante la formación de ADN de cadena sencilla. No obstante, la acción de AID ha de requerir factores adicionales, pues no todos los genes que se transcriben son diana de esta enzima potencialmente mutadora, sino que su acción se restringe a los genes de las inmunoglobulinas.
De manera más general, tanto la mutación espontánea como la recombinación de una secuencia particular de ADN son significativamente más altas cuando ésta se transcribe. Esto se ha descrito tanto en procariotas como en eucariotas y se conoce como TAM (mutación asociada a transcripción) y TAR (recombinación asociada a transcripción) (Aguilera, 2002). No obstante y a pesar de su universalidad, la bases moleculares de TAM y TAR no están del todo claras.
Para explicar cómo la transcripción estimula la inestabilidad de una determinada secuencia es importante tener en cuenta que el ADN es más inestable cuando se encuentra en forma de cadena sencilla (Lindahl, 1993), ya que durante el proceso de la elongación transcripcional se generan cambios topológicos, como la acumulación de superenrrollamiento negativo, y reordenaciones en la cromatina que pueden dar lugar de manera transitoria a regiones de ADN en forma de cadena sencilla (Kim et al., 2007; Schmidt et al., 2006), más susceptible de recombinar y mutar. De hecho, los efectos de la transcripción sobre la recombinación en S. cerevisiae aumentan de forma sinérgica con la inducción de daños producidos por agentes químicos (Garcia-Rubio et al., 2003).
Sin embargo, parece que la mayor accesibilidad de la molécula de ADN durante su transcripción no es la única causa de TAR. Se ha propuesto que la transcripción puede frenar o incluso bloquear el paso de las horquillas de replicación. El bloqueo de la replicación puede derivar en el colapso de las horquillas, el desensamblaje del replisoma, y la generación de roturas en el ADN que requieren de la maquinaria de recombinación para su reparación (Lopes et al., 2001; Sogo et al., 2002; Tercero and Diffley, 2001). De hecho, se ha descrito cómo la replicación se ralentiza y puede llegar a colapsar en genes trascritos por las ARN polimerasas I, II y III (Deshpande and Newlon, 1996; Prado and Aguilera, 2005; Takeuchi et al., 2003). Esta situación es más evidente en ausencia de la helicasa Rrm3 (Ivessa et al., 2003; Prado and Aguilera, 2005), lo que indica que existen mecanismos activos, como esta helicasa, para que la replicación pueda superar los obstáculos presentes en el ADN tales como la ARN polimerasa transcribiendo. De hecho, experimentos de ChIP on chip han demostrado que Rrm3 se encuentra en todos los genes que se transcriben (Azvolinsky et al., 2006) lo que apoya esta idea de que la transcripción constituye un obstáculo para la replicación. En la misma línea, estudios genéticos demuestran que TAR ocurre sólo en la fase S del ciclo celular (Prado and Aguilera, 2005), mientras que la frecuencia de TAM no se ve afectada por la replicación (Kim et al., 2007).
La elongación de la transcripción en eucariotas está acoplada a una serie de pasos del procesamiento del ARNm naciente para formar la ribonucleopartícula proteica (mRNP) y su transporte del núcleo al citoplasma a través del poro nuclear (Aguilera, 2005; Keene, 2007). Mutaciones en los genes implicados en la conexión de estos procesos generan una fuerte TAR (Fan et al., 2001; Gallardo et al., 2003; Luna et al., 2005; Prado et al., 1997). El caso más estudiado lo encontramos en los mutantes del complejo THO, en los que se da una fuerte hiper-recombinación asociada a transcripción.
El complejo THO está formado por las proteínas Tho2, Hpr1, Mft1 y Thp2 y funciona en la interfase transcripción-transporte del ARNm mediante su interacción con la ATPasa dependiente de ARN Sub2 y la proteína de unión a ARN Yra1. Todas estas proteínas forman un macrocomplejo conocido como TREX (Chavez et al., 2000; Strasser et al., 2002). Los mutantes del complejo THO comparten fenotipos de defectos en elongación de la transcripción y en el transporte de ARNm al citoplasma junto a la citada fuerte hiper-recombinación dependiente de transcripción, lo que se ha observado principalmente en genes largos y de alto contenido en GC o con múltiples repeticiones internas (Chavez et al., 2001; Voynov et al., 2006). El origen de la fuerte TAR de los mutantes THO no está del todo claro pero se ha relacionado tanto con la formación co-transcripcional de un R-loop como con la obstaculización de la replicación.
En los mutantes THO el ARNm no se ensambla de manera correcta ni interacciona bien con las proteínas responsables de su posterior transporte al citoplasma, lo que promueve la formación co-transcripcional de un R-loop, en el que el ARNm naciente forma un híbrido más o menos estable con la cadena no transcrita, que ha sido descrito como responsable de la hiper-recombinación (Huertas and Aguilera, 2003). De manera similar, se ha descrito una conexión entre la formación de R-loops y la inestabilidad genética en mutantes en el complejo de splicing ASF/SF2 de células de pollo y humanas (Li and Manley, 2005). Por otra parte, los mutantes THO provocan una disminución en la velocidad de las horquillas de replicación, que también ha sido propuesto como causa de la fuerte TAR observada (Wellinger et al., 2006). Sin embargo, no se conoce si existe conexión entre la formación del R-loop y los problemas que se generan durante replicación en los mutantes THO.
El objetivo principal de la investigación desarrollada durante esta tesis ha consistido en profundizar en el conocimiento de las causas que originan la inestabilidad genética asociada a transcripción. Particularmente, hemos trabajado con distintos mutantes en el complejo THO, en los que se han descrito fenotipos de alta inestabilidad asociada a transcripción. Para ello, hemos desarrollado nuevos sistemas genéticos capaces de medir la frecuencia de mutación y recombinación en distintas condiciones de transcripción y en distintos fondos mutantes en la levadura S. cerevisiae.
De una parte, para tratar de entender el porqué de la actuación de AID en ciertas secuencias y no otras, hemos estudiado las consecuencias de la expresión heteróloga de la proteína humana AID en la levadura. Dado que se ha visto que en las regiones S de los genes de las inmunoglobulinas se forman híbridos ADN-ARN que parecen estar implicados en la especialidad de acción de AID, y que los mutantes THO de la levadura facilitan la formación de estos híbridos durante la transcripción, nos preguntamos si la acción de AID podría estar facilitada en dichos mutantes, de manera que pudiésemos imitar en la levadura la situación que en realidad ocurre en células B. Así, hemos observado como la expresión heteróloga de la proteína humana AID en S. cerevisiae induce un aumento de las frecuencias de mutación y recombinación de manera dependiente de transcripción. Además, tanto la hiper-mutación como la hiper-recombinación inducidas por AID aumentan de manera sinérgica en mutantes del complejo THO y otras proteínas relacionadas, como Thp1. La caracterización molecular del tipo de mutaciones originadas ha desvelado que AID actúa preferentemente en la cadena no transcrita del ADN, lo que apoya la teoría de que el híbrido ADN-ARN que se forma en dichos mutantes favorece la acción de AID.
Con objeto de estudiar el posible papel de los híbridos ADN-ARN como obstáculo para la replicación y sus implicaciones en TAR, hemos utilizado el mutante puntual hpr1-101, que comparte con los otros mutantes THO el fuerte defecto transcripcional, si bien no presenta un fenotipo de hiper-recombinación asociada a transcripción (Huertas et al., 2006). Es, por tanto, el primer caso en el que se separan los fenotipos de trancripción e hiper-recombinación. El análisis de la frecuencia de mutación nos ha revelado que la expresión de AID aún tiene efecto hiper-recombinador e hiper-mutador en hpr1-101, aunque el análisis de las mutaciones obtenidas indica que actúa en ambas cadenas (transcrita y no transcrita), lo que muestra que en hpr1-101 no se generan híbridos ADN-ARN. Esto implica que defectos en el procesamiento del ARNm pueden generar una acumulación de superenrrollamiento tras la ARN polimerasa responsable de una mayor accesibilidad del ADN a AID sin que exista un híbrido ADN-ARN. Además, dado que la replicación se ve obstaculizada en los mutantes THO y no en hpr1-101 (Huertas et al., 2006), podemos concluir que el R-loop es la causa de dicha obstaculización de la replicación.
Además, para entender el papel que la replicación tiene en el origen de TAM y TAR, concretamente en los mutantes THO, hemos buscado posibles interacciones genéticas de THO, con una batería de mutantes en genes involucrados en los procesos de replicación, puntos de verificación del ciclo (checkpoints), reparación del ADN y remodelación de la cromatina. De dicho análisis se concluye que la deleción de genes involucrados en el checkpoint de fase S como son RAD24, MEC1, RAD53, DDC1, MEC3 y RAD17 provoca un defecto de crecimiento en los mutantes en el complejo THO. Dicho defecto es exacerbado en presencia de estrés replicativo, de lo que se concluye que los genes implicados en el checkpoint de fase S son esenciales para la supervivencia de los mutantes THO en presencia de estrés replicativo. Hemos observado que, en ausencia del checkpoint de fase S, las células mutantes en el complejo THO se acumulan en la fase G2 del ciclo, lo que parece mediado por el checkpoint mitótico. Es más, los dobles mutantes en THO y dichos factores de checkpoint de fase S presentan altos niveles de inestabilidad genética. Esta se ha medido como focos de reparación, hiper-recombinación o tasa de reordenamientos cromosómicos, probablemente como consecuencia de su papel en el mantenimiento de la estabilidad de las horquillas de replicación.
Por último, el análisis de la replicación en un gen cromosómico de alta transcripción mediante la técnica de geles bidimensionales de ADN nos ha revelado que en los mutantes THO existe una acumulación de intermediarios replicativos. Estos resultados concuerdan con los datos previamente publicados en los que se describió en un sistema plasmídico un defecto en replicación asociado a transcripción en los mutantes THO (Wellinger et al., 2006) y prueba que, de manera general, la transcripción genera problemas replicativos en ausencia del complejo THO.
Como modelo general podemos decir que el correcto funcionamiento de la transcripción evita la acumulación de superenrrollamiento negativo tras la ARN polimerasa que favorecería la formación de regiones de ADN de cadena sencilla, más susceptible de ser mutada o atacada por metabolitos internos o enzimas potencialmente mutagénicas. Además, el procesamiento co-transcripcional del ARNm naciente tiene un papel en el mantenimiento de la estabilidad genética, ya que evita la formación de híbridos ADN-ARN. Estos híbridos no sólo favorecen la formación de regiones de ADN de cadena sencilla en la cadena transcrita, sino que además constituyen un obstáculo para la progresión de las horquillas replicativas. La colisión de la replicación con los híbridos ADN-ARN generarían estructuras que desencadenan la activación de los checkpoints, lo que es esencial para el mantenimiento de las horquillas y la supervivencia celular.
