Resumen de New systems and new factors in nuclear and mitochondrial genomic instability in yeast
INTRODUCCIÓN El ADN está sometido a diferentes mecanismos para su replicación y la expresión de la información contenida en la doble hélice, así como a una gran variedad de agentes dañinos, tanto exógenos como producidos por el mismo metabolismo celular (como puede ser el daño oxidativo provocado en la mitocondria durante la respiración). Para controlar estos procesos y reparar las posibles lesiones en el ADN existen mecanismos que previenen o reparan dichas anomalías.
El objetivo de esta tesis durante la duración de la beca ha sido el estudio de distintos aspectos relacionados con el metabolismo del ADN y la inestabilidad genética. En este sentido se han desarrollado dos sistemas que nos permiten estudiar los mecanismos celulares para la protección del material genético.
Hemos utilizado como organismo modelo de eucariotas la levadura Saccharomyces cerevisiae. Cada uno de los sistemas aborda la distintos aspectos de la dinámica de toda la información genética de la célula, contenida en dos compartimentos diferentes: el ADN nuclear y el ADN mitocondrial.
En lo referente al posible efecto de la transcripción por parte de la polimerasa III de ARN hemos llevado a ensayos para determinar los niveles de recombinación del ADN, acompañados por el análisis de la replicación mediante geles bidimensionales. Hemos construido un sistema de recombinación plasmídico en el cual tenemos una versión del gen LEU2 truncado con dos repeticiones directas(1), de manera que el tRNA SUP53 se encuentra clonado entre ambas repeticiones. La expresión del tRNA es constitutiva(2), y la frecuencia de recombinación puede detectarse por la aparición de colonias que han recuperado la prototrofía para la leucina. La expresión del gen LEU2 está regulada por el promotor GAL1 para evitar la interferencia de la transcripción por la ARN polimerasa II.
La transcripción del tRNA por la polimerasa III se puede verificar por dos vías diferentes: -Visualización directa del ARN mediante análisis de Northern Blot.
-Geles Bidimensionales de ADN: esta descrito que el locus del tRNA genera una pausa en la horquilla de replicación cuando se transcribe activamente(2, 3).
Para incrementar el efecto de la transcripción del tRNA SUP53 se realizaron estos análisis en el mutante nulo rrm3¿ (4)ya que se ha descrito que la helicasa Rrm3 es fundamental para permitir que la horquilla de replicación supere barreras en el ADN como pueden ser las "Replication Fork Barriers(5)" y los tRNA(2).
ANTECEDENTES: 1.Estudio de la recombinación inducida por la transcripción de la ARN polimerasa III.
La ARN polimerasa II se encarga de la transcripción de los ARN mensajeros y está ampliamente caracterizada. Además de su función como proteína de síntesis de ARN, está descrito que su acción genera un ligero aumento de la inestabilidad genética (monitorizado como un aumento en la frecuencia de recombinación en diversos sistemas)(6) que se hace mucho más patente cuando se añaden agentes dañinos del ADN como puede ser el 4-Nitroquinoline 1-oxide (4NQO)(7).
La ARN polimerasa III se encarga de la transcripción de los ARN transferente, ARN ribosómico de 5S y otros pequeños ARN encontrados en el núcleo celular y en el citoplasma. En esta tesis se ha construido un sistema que nos permite estudiar el efecto de la transcripción por la ARN polimerasa III del mismo modo que se ha analizado para la polimerasa II de ARN(7).
2. Estudio de la inducción de daño específico en el ADN mitocondrial.
La levadura S. cerevisiae posee la capacidad de obtener energía tanto mediante metabolismo respiratorio como fermentativo. Esto nos permite trabajar con células a las cuales se les ha eliminado la función mitocondrial, por lo que podemos inducir daño en el ADN mitocondrial y analizar las consecuencias: activación de vías de reparación en la mitocondria, checkpoint. etc.Para inducir daño en la mitocondria se eligió un alelo mutante de la topoisomerasa I de ADN (el alelo top1-103). La topoisomerasa I en condiciones silvestres tiene localización nuclear y actúa modificando el enrollamiento del ADN(8)). Su acción comienza con la generación de un nick en el ADN al que permanece unida temporalmente. En ciertas condiciones esta acción puede ser perjudicial para la célula, al formarse un complejo covalente entre la proteína y el ADN que debe ser reparado. Esas condiciones incluyen la adición de drogas como la camptotecina(9) o ciertos mutantes de similar efecto(10), como es el alelo top1-103(11).
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 1.Estudio de la recombinación inducida por la transcripción de la ARN polimerasa III.
La transcripción del tRNA SUP53 tiene un efecto en el aumento de la inestabilidad genética que se ve ligeramente amplificado en presencia de drogas como el 4NQO. Dicho efecto es mucho más notable cuando se trabaja con el mutante rrm3¿, una helicasa que ayuda a superar barreras para la horquillad e replicación. En este sentido, la pausa de la horquilla de replicación (RFP) que con frecuencia localiza en el tRNA debe ser esencial para aumentar la inestabilidad del esa región del genoma.
2. Estudio de la inducción de daño específico en el ADN mitocondrial.
Se ha generado un sistema que nos permite inducir un daño específico en la mitocondria, que podemos visualizar mediante la localización de la proteína GFP, el análisis de la formación de "petite" y la pérdida de ADN mitocondrial. Así mismo se ha observado que la camptotecina parece no tener un efecto en la proteína silvestre mitocondrial, lo cual indicaría que dicha droga no es capaz de penetrar en el interior de la mitocondria.
En el futuro queremos llevar a cabo ensayos para caracterizar la reacción de la célula ante la inducción de daño en el ADN mitocondrial, definiendo con mas aproximación el tipo de pérdida mitocondrial que genera nuestra proteína y las vías de reparación que actúan ante este tipo de eventos, diferenciándolos de aquellas que actúan en el núcleo.
METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO Respecto al material genético nuclear se ha creado un sistema plasmídico que nos permite estudiar el efecto de la transcripción de la ARN polimerasa III (12) a través del análisis de la frecuencia de recombinación cuando un tRNA está siendo transcrito sin y con la presencia un agente dañino para el ADN. Si bien la maquinaria de reparación nuclear se encuentra ampliamente caracterizada, las vías de reparación del ADN que actúan en la mitocondria son aún desconocidas. Para poder profundizar mas en el mundo de la mitocondria hemos creado un sistema mediante el cual podemos dirigir una proteína mutada (11)genuinamente de localización nuclear (la topoisomerasa I de ADN(8)) de manera exclusiva a la mitocondria. Cuando se sobrexpresa dicha proteína mutada provoca la muerte celular al actuar en el núcleo, sin embargo, en nuestro sistema, al dirigirlo a la mitocondria el daño en el ADN mitocondrial genera la pérdida de función mitocondrial, que puede visualizarse por la aparición de colonias"petite" , de metabolismo fermentativo(13-15).
2. Estudio de la inducción de daño específico en el ADN mitocondrial.
La levadura S. cerevisiae posee la capacidad de obtener energía tanto mediante metabolismo respiratorio como fermentativo. Esto nos permite trabajar con células a las cuales se les ha eliminado la función mitocondrial, por lo que podemos inducir daño en el ADN mitocondrial y analizar las consecuencias: activación de vías de reparación en la mitocondria, checkpoint. etc.Para inducir daño en la mitocondria se eligió un alelo mutante de la topoisomerasa I de ADN (el alelo top1-103). La topoisomerasa I en condiciones silvestres tiene localización nuclear y actúa modificando el enrollamiento del ADN(8)). Su acción comienza con la generación de un nick en el ADN al que permanece unida temporalmente. En ciertas condiciones esta acción puede ser perjudicial para la célula, al formarse un complejo covalente entre la proteína y el ADN que debe ser reparado. Esas condiciones incluyen la adición de drogas como la camptotecina(9) o ciertos mutantes de similar efecto(10), como es el alelo top1-103(11). En este trabajo se ha construido una fusión de la topoisomerasa mutante top1-103 con una señalización de localización mitocondria contenida en el gen SOD2(16) y la proteína fluorescente GFP(17), que nos permite visualizar la localización de la proteína quimera. Así mismo se han construido diversos controles para confirma la actividad de nuestra proteína modificada.
Se han construido también versiones silvestres de la topoisomerasa para testar el efecto de la camptotecina en la mitocondria.
De estas construcciones se ha analizado tanto la localización celular como el efecto en el crecimiento y la aparición de colonias"petite".
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