Estudio del carácter endófito de bacterias aisladas de plantas de arroz en las marismas del Guadalquivir.

• Autores: Manuel Esaú Megías Saavedra
• Directores de la Tesis: Manuel Megías Guijo (dir. tes.), Francisco Javier Ollero Márquez (dir. tes.), Carolina Sousa Martín (tut. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Sevilla ( España ) en 2013
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: María del Carmen Márquez Marcos (presid.), Miguel Ángel Caviedes Formento (secret.), Fabio Bueno Dos Reis Jr (voc.), José Olivares Pascual (voc.), Federico Sánchez Rodríguez (voc.)
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• Resumen

  • El arroz es uno de los cereales más importantes para la alimentación mundial. Se estima que el arroz aporta el 20% del suministro de energía alimentaria del mundo, siendo mayor este porcentaje en los países en vías de desarrollo. Esto hace que sea el segundo cereal más cultivado después del trigo, ocupando una superficie global de cultivo de 180 millones de Ha en 2013. En Andalucía, el arroz se cultiva casi en su totalidad en las marismas del Guadalquivir, una región que comprende tres provincias, Huelva, Sevilla y Cádiz, y un total de 137.000 Ha, 38.000 de las cuales están dedicadas al cultivo de arroz. Esta región presenta unas condiciones de temperatura y humedad idóneas para el desarrollo del cultivo.

    El arroz (Oryza sativa) es una planta monocotiledónea englobada dentro de la familia de las gramíneas. Se trata de una planta herbácea, anual y con una altura que oscila entre los 80 y los 150 cm, según la variedad y las condiciones de cultivo. Como la mayor parte de las plantas, el arroz presenta una amplia diversidad de bacterias asociadas, que se distribuyen en tres hábitats diferentes: el suelo rizosférico, la superficie de la planta y el interior de los tejidos vegetales. Son estás ultimas, las denominadas bacterias endófitas, las que han sido objeto de estudio del presente trabajo.

    La definición más aceptada de endófito es la enunciada por Hallman et al. (1997), que establece que una bacteria endófita es aquella que puede ser aislada del interior de una planta o tejido vegetal esterilizado superficialmente, y no provoca daños aparentes en la planta. Existe una gran diversidad de bacterias cultivables y no cultivables que habitan en el interior de la planta de arroz. El principal interés que despiertan las bacterias endófitas es la capacidad de algunas especies de actuar como promotoras del crecimiento vegetal, por medios directos como la fijación de nitrógeno y la producción de fitohormonas, o indirectos como agentes antagonistas frente a posibles patógenos o favoreciendo la disponibilidad de nutrientes minerales.

    Entre las bacterias endófitas descritas en la planta de arroz, se encuentran bacterias del género Pantoea, un género englobado dentro de la familia Enterobacteriaceae. Se trata de un género ubicuo que actualmente comprende 19 especies reconocidas, algunas de las cuales han sido descritas como patógenas de plantas o incluso patógenas oportunistas del hombre. Sin embargo, también existen numerosas evidencias de bacterias del género Pantoea con capacidad para promover el crecimiento vegetal, ya sea por solubilización de fosfatos (Kim et al., 2012b), por producción de fitohormonas (Feng et al., 2006) o por antagonismo frente a bacterias y hongos fitopatógenos (Pusey et al., 2011). La controversia que suscita este género y el notable número de aislados que se han recuperado del interior de plantas de arroz de las marismas del Guadalquivir, ha convertido a las bacterias endófitas de arroz pertenecientes al género Pantoea en el objeto de estudio de esta Tesis.

    La hipótesis planteada buscaba responder a la cuestión de si las cepas del género Pantoea aisladas de las plantas de arroz en las marismas del Guadalquivir se comportaban como endófitos y no como patógenos de la planta, y si se podían obtener cepas con potencial biotecnológico para desarrollar inoculantes que se puedan aplicar en cultivos de interés. Para responder a esta hipótesis se plantearon cuatro objetivos: 1- Clasificar taxonómicamente las cepas del género Pantoea aisladas y estudiar las relaciones filogenéticas de las mismas dentro del género.

    2- Estudiar el carácter endófito de las cepas seleccionadas y estudiar los posibles factores que inciden en la colonización de la planta por parte de la bacteria endófita.

    3- Estudiar las características PGPR de las cepas confirmadas como pertenecientes al género Pantoea en el objetivo 1.

    4- Estudiar el efecto de algunas cepas seleccionadas sobre diferentes cultivos de interés agronómico.

    Los análisis filogenéticos llevados a cabo permitieron determinar que de los 29 aislados, clasificados inicialmente como cepas del género Pantoea por secuenciación del ADNr 16S, 2 de ellos no pertenecían al género y las 27 restantes se distribuían en 4 grupos taxonómicos, 3 dentro de especies conocidas y un grupo taxonómico que se ha denominado ¿grupo problema¿. En cuanto a este ¿grupo problema¿, las evidencias obtenidas en los diferentes ensayos (MLSA, API50CH y ácidos grasos totales), y a falta de una confirmación por técnicas filogenéticas clásicas, permiten suponer que se trata de una posible nueva especie que se ha denominado en este trabajo como Pantoea oryzae.

    Los ensayos del carácter endófito confirmaron, de acuerdo a diferentes autores (Rosenbleuth and Martínez Romero, 2006; Gagne-Bourge et al., 2012; Torres et al., 2013), que las cepas del género Pantoea ensayadas se comportaban como verdaderos endófitos. A pesar de este hecho, sería interesante llevar a cabo ensayos basados en microscopía que permitieran dar un mayor apoyo a los resultados obtenidos, tal y como proponen algunos autores (Reindhold-Hurek and Hurek, 1998b). Igualmente, estos mismos ensayos han permitido poner de manifiesto que la movilidad de tipo swimming y la capacidad de producir moléculas de señalización celular, incidían sobre la colonización de los tejidos aéreos de la planta.

    De los resultados obtenidos en los experimentos para la determinación de características PGPR de los aislados, destaca la gran variedad de propiedades que presentan las cepas analizadas, así como el hecho de que existen cepas que presentan un amplio número de características. Por este motivo estas cepas podrían ser utilizadas como inoculantes para la mejora de rendimientos de cosecha en el marco de una agricultura más sostenible. Como resumen de las características PGPR que presentan las cepas analizadas se puede indicar que del total de 27 cepas: 19 son movilizadoras de fosfatos, 11 presentan capacidad de producir auxinas, 6 tienen actividad ACC desaminasa y 13 producen sideróforos. Son cepas que en su mayoría (15 de 27 aislados) tienen capacidad de producir moléculas de comunicación, que pueden jugar un papel importante tanto en el carácter endófito como en el antagonismo frente a bacterias y hongos fitopatógenos. De hecho, todos los aislados estudiados tienen la facultad de inhibir el crecimiento ¿in vitro¿ de las bacterias u hongos fitopatógenos seleccionados para este trabajo.

    Dadas las características de promoción del crecimiento vegetal de estos aislados, se han seleccionado al menos cuatro bacterias con diferentes propiedades PGPRs que se han aplicado en cultivos controlados de fresa, tomate y arroz, y se ha comprobado si ejercían un efecto positivo sobre dichos cultivos. Los experimentos se han llevado a cabo en condiciones controladas de invernadero para plantas de fresa y tomate, o en parcelas de experimentación para plantas de arroz. Se ha estudiado fundamentalmente el comportamiento de las bacterias sobre el sistema radical y la parte aérea de la planta. Las cepas AMG449, AMG520 y AMG521, fueron capaces de promover el crecimiento en plantas de fresa y la cepa AMG449 fue la que produjo los mejores resultados en plantas de arroz.

    De los resultados obtenidos, se han propuesto las siguientes conclusiones: 1- El género Pantoea está representado en las marismas del Guadalquivir por 3 especies, Pantoea dispersa, Pantoea deleyi y Pantoea ananatis, y un grupo taxonómico que, dadas las evidencias presentadas en los ensayos realizados (MLSA, API50CH y ácidos grasos totales), se propone como una nueva especie, Pantoea oryzae.

    2- Las cepas estudiadas en el presente trabajo se comportan como endófitos de la planta de arroz.

    3- El carácter endófito está regulado por, entre otros factores, la movilidad bacteriana de tipo swimming y la producción de moléculas de comunicación celular.

    4- Las cepas estudiadas presentan una elevada heterogeneidad en sus características PGPR y dada la combinación de características que presentan alguna de estas cepas, podrían utilizarse con fines comerciales ya sea como agentes movilizadores de nutrientes, como agentes de biocontrol o como bioprotección frente a diferentes condiciones de estrés.

    5- Las cepas AMG449, AMG520 y AMG521 son capaces de promover el crecimiento de plantas de fresa, mejorando diferentes parámetros de las mismas. En plantas de arroz es la cepa AMG449 la que presenta mejores resultados.