Síntesis de levaduras enriquecida en azufre 34 y su aplicación en estudios clínicos y metabólicos
- Autores: Oscar Galilea San Blas
- Directores de la Tesis: José Ignacio García Alonso (dir. tes.), Juan Manuel Marchante Gayón (codir. tes.)
- Lectura: En la Universidad de Oviedo ( España ) en 2016
- Idioma: español
- Tribunal Calificador de la Tesis: Pilar Bermejo Barrera (presid.), Pablo Rodríguez González (secret.), Martín Resano Ezcaray (voc.)
- Materias:
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- Tesis en acceso abierto en: RUO
- Resumen
La búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades en general y tumores malignos en particular es uno de los grandes campos de investigación clínica. De los diferentes tejidos y fluidos que pueden ser objeto de análisis, la orina constituye una muestra ideal para la monitorización de estas sustancias dado que no requiere de métodos invasivos. Además, los perfiles metabolómicos en orina están siendo objeto de investigación para desarrollar nuevos ensayos clínicos basados en este tipo de biomarcadores.
Por otro lado, las técnicas hibridas que combinan potentes técnicas de separación cromatográficas o electroforéticas con la espectrometría de masas en general y la espectrometría de masas con fuente ICP en particular abre la posibilidad de nuevas estrategias analíticas dentro de este campo.
En nuestro caso, basándonos en estudios previos realizados en nuestro laboratorio, hemos evaluado la posibilidad de utilizar las medidas de relaciones isotópicas de azufre en los metabolitos presentes en la orina como método para detectar pacientes con determinadas patologías como por ejemplo cáncer de próstata. La hipótesis fue la siguiente: al suministrar una dosis de levadura enriquecida en 34S a un individuo sano y a un paciente, si el metabolismo de estos individuos es diferente como consecuencia de la enfermedad, debería observarse la aparición de un enriquecimiento isotópico en azufre diferente en algunos de los metabolitos de azufre presentes en la orina de estos individuos. El objetivo principal de esta tesis doctoral fue evaluar si esto es así o no, ya que en caso afirmativo estos metabolitos podrían proponerse como posibles biomarcadores de la enfermedad.
1- Síntesis de levadura enriquecida en azufre 34 En primer lugar se procedió a sintetizar levadura Saccharomyces Cerevisiae enriquecida en azufre 34. Para ello se partió de la experiencia previa en nuestro grupo de investigación en este campo, pero modificando y optimizando algunos aspectos de los métodos anteriormente desarrollados con objeto de obtener un enriquecimiento mayor en el isótopo 34 del azufre. Esta levadura se empleó en los estudios posteriores.
Por otro lado, se preparó un patrón de metionina enriquecida isotópicamente a partir de la levadura sintetizada, con objeto de utilizarla en la determinación de metionina en muestras de interés clínico. En este sentido, se ha puesto a punto un método para la determinación de metionina en suero humano mediante dilución isotópica HPLC-ICP-MS. Este método fue validado comparando los resultados obtenidos por nuestro método con los del HUCA utilizando un método alternativo.
2. Desarrollo de una metodología analítica cuantitativa para la monitorización de metabolitos de azufre en orina Era esperable que los enriquecimientos isotópicas de azufre en los metabolitos presentes en la orina tras una dosis única de levadura enriquecida fuesen muy pequeños. Para poder detectar diferencias entre individuos sanos y enfermos es necesario utilizar técnicas que alcancen una alta precisión en la medida de relaciones isotópicas. Por ello, se han comparado dos equipos ICP-MS de doble enfoque, uno con detección secuencial y otro con detección simultaena, fundamentalmente en lo que se refiere a la precisión en la medida de relaciones isotópicas. Los resultados mostraron una clara ventaja del equipo multicolector midiendo relaciones isotópicas de azufre con los SEM a bajas concentraciones o con las copas de Faraday a concentraciones elevadas.
Por otro lado, se ha desarrollado un método HPLC para separar los principales metabolitos de azufre en orina, comparando diferentes tipos de cromatografía resultando la cromatografía de fase reversa la que permitía la separación de un mayor número de metabolitos. Además, se utilizó un novedoso sistema de desolvatación que permitía utilizar altas concentraciones de disolvente orgánico en las fases móviles.
Finalmente con objeto de cuantificar el azufre endógeno y exógeno presente en cada pico cromatográfico, se añadía en continuo un flujo post-columna de azufre 33 enriquecido y se aplicó la herramienta matemática de IPD.
3. Evaluación del enriquecimiento isotópico de azufre en orina de animales de laboratorio tras suminístrales una dosis de levadura enriquecida.
Se realizaron estudios tanto en ratas Wistar como en ratones C57 tras administrarles una dosis de levadura enriquecida en 34S. Los primeros estudios revelaron que la marca isotópica se podía observar en compuestos de azufre excretados en la orina, encontrándose a las 12 horas el máximo de este enriquecimiento.
Posteriormente, se realizaron estudios entre ratones sanos y enfermos de cáncer de próstata para buscar diferencias en el enriquecimiento de azufre entre estas dos poblaciones. Un primer estudio reveló ciertas diferencias en animales sanos y enfermos en un estadio avanzado de la enfermedad. Por ello, se realizó un segundo estudio de los diferentes estadios de la enfermedad durante 40 semanas. Se observaron diferencias entre las poblaciones de ratones sanos y enfermos, desde estadios iniciales, utilizando para el tratamiento de datos técnicas quimiométricas, tanto en lo que se refiere a la identificación de los compuestos que presentaban un comportamiento distinto en ambas poblaciones, como para establecer diferencias globales entre las mismas
