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Caracterizacion genomica de la leucemia mieloide aguda

  • Autores: Javier Suela Rubio
  • Lectura: En la Universidad Autónoma de Madrid ( España ) en 2008
  • Idioma: español
  • Enlaces
  • Resumen
    • ÍNDICE............................................................................I Abreviaturas ............................................................XI Relación de tablas............................................................XV Relación de figuras.......................................................XVII Abstract ........................................................... XIX Resumen.................................................................. XXIII INTRODUCCIÓN......................................................... 1 1. El cáncer es una enfermedad genética. ......................................................... 3 2. Las enfermedades mieloides. ............................................... 5 2.1. Clasificación de las enfermedades mieloides. .......................................... 7 3. La leucemia mieloide aguda. ............................................. 7 3.1. Sistemas de clasificación de la LMA....................................................... 8 3.1.1. LMA mínimamente o no diferenciada (M0). ................... 9 3.1.2. LMA sin maduración (M1)........................................................................ 10 3.1.3. LMA con maduración (M2) .................................... 10 3.1.4. Leucemia promielocítica aguda (M3) ........................ 10 3.1.5. Leucemia mielomonocítica aguda (M4) ...................... 11 3.1.6. Leucemia monocítica aguda (M5) ............................................................ 11 3.1.7. Leucemia eritrocítica aguda o eritroleucemia (M6) ................................. 11 3.1.8. Leucemia megacariocítica aguda (M7) .................................................... 12 3.2. La citogenética en la leucemia mieloide aguda.................... 12 IV 3.2.1. Grupo de riesgo favorable. ............................... 14 3.2.1.1. LMA con t(15;17)(q22;q21): leucemia promielocítica aguda (LPA). ..........14 3.2.1.2. LMA con con t(8;21)(q22;q22).........................15 3.2.1.3. LMA con inv(16)(p13;q22): leucemia mielomonocítica aguda con eosinofilia. ........................................16 3.2.2. Grupo de riesgo intermedio ....................................................................... 17 3.2.2.1. LMA con cariotipo normal (CN) ..................................18 3.2.2.2. LMA con trisomía 8..............................................18 3.2.3. Grupo de riesgo adverso ............................................. 18 3.2.3.1. LMA con reordenamientos que implican el gen MLL...........18 3.2.3.2. LMA con cariotipo complejo. .......................................................................19 3.2.4. Efecto de alteraciones adicionales en LMA con alteraciones pronósticas. 19 3.3. La genética molecular en la leucemia mieloide aguda ............................22 3.4. La genómica en la leucemia mieloide aguda .........................22 OBJETIVOS ..........................................................27 MATERIAL Y MÉTODOS .....................................................................................31 1. Material y técnicas básicas...............................................33 1.1. Selección de pacientes. ...................................................33 1.1.1. Análisis de la información de número de copia del ADN utilizando herramientas de array-CGH................................................................................. 33 1.1.2. Análisis combinado de número de copia y pérdida de heterocigosidad neutra utilizando herramientas de array-SNP ...................................................... 34 1.1.3. Selección de pacientes de LMA para realizar tissue microarrays (TMA) . 34 V 1.2. Extracción de ADN. ................................................. 34 1.3. Obtención de suspensiones citogenéticas............................. 34 1.4. Producción de tissue microarrays ................................ 35 2. Herramientas de arrays genómicos............................................................. 35 2.1. Array-CGH de oligonucleótidos............................................................ 35 2.1.1. Digestión del ADN con enzimas de restricción............... 35 2.1.2. Marcaje mediante cebado aleatorio. .......................................................... 36 2.1.3. Preparación de la solución de hibridación................................................. 36 2.1.4. Hibridación.................................................... 37 2.1.5. Lavado del array hibridado..................................... 37 2.1.5. Tratamiento de las imágenes .................................... 37 2.2. Array de SNP......................................................... 38 2.3. Análisis de los datos............................................ 42 2.3.1. Análisis de calidad y visualización de los arrays de CGH ........................ 42 2.3.2. Análisis de calidad y visualización de los arrays de SNP ......................... 43 2.3.3. Estimación del número de copias (VNC) y determinación de las regiones43 2.3.4. Eliminación de polimorfismos de número de copia conocidos .... 44 2.3.5. Cálculo de la pérdida de heterocigosidad .................... 44 2.3.6. Estudio de regiones de homocigosidad (LOH no debidas a enfermedad) en donantes sanos ............................................................. 44 VI 2.3.7. Determinación de las regiones mínimas recurrentes (RMR) del estudio (número de copia y LOH).............................................. 45 2.3.8. Análisis bioinformáticos de agrupamiento y selección de regiones candidatas en array-CGH y array-SNP.................................... 45 3. Hibridación in situ fluorescente (FISH) ..............................46 3.1. Obtención de sondas para FISH...................................47 3.1.1. Diseño de las sondas.................................................... 47 3.1.2. Cultivo de los clones bacterianos .............................................................. 47 3.1.3. Extracción del ADN plasmídico.......................... 48 3.1.4. Marcaje de la sonda ......................................................... 49 3.2. Protocolo de FISH.......................................................50 3.2.1. Preparación de la sonda ...................................... 51 3.2.2. Preparación de la muestra........................................... 51 3.2.2.1. Envejecimiento de las suspensiones citogenéticas........51 3.2.2.2. Preparación de tissue-microarrays utilizando el protocolo DAKO FISH kit modificado. ..........................51 3.2.3. Hibridación, desnaturalización e incubación .................... 52 3.2.4. Lavados post-hibridación...................................... 52 3.2.5. Captura y análisis de las imágenes ........................... 52 3.2.6. Descripción de las sondas utilizadas.......................... 53 4. Secuenciación genómica................................................53 5. Inmunohistoquímica .......................................................55 VII 6. Análisis estadístico....................................................................................... 56 RESULTADOS......................................................................... 59 1. Estudio genómico de una serie de LMA de novo utilizando array-CGH... 61 1.1. Descripción clínica de la serie ......................................... 61 1.2. Descripción genómica de la serie ................................... 62 1.3. Desarrollo de la clasificación genómica................................................. 64 1.4. Comparación de la clasificación genómica con la citogenética .............. 65 1.5. Estudio de supervivencia global en LMA....................... 66 1.5.1. Impacto de las variables clínicas y genómicas en la supervivencia utilizando el test univariante de Log-Rank................................ 66 1.5.1.1. Estudio de las variables clínicas y genómicas sobre la cohorte completa .... 66 1.5.1.2.Estudio de las variables clínicas y genómicas sobre el grupo de LMA de cariotipo normal. .......... 68 1.5.2. Independencia de las variables clínicas y genómicas en la supervivencia utilizando el test multivariante de Cox ....................... 69 1.6. Definición de las regiones mínimas recurrentes (RMR-r) ...................... 70 2. Estudio genómico de LMA de novo utilizando array-SNP.............. 73 2.1. Análisis de regiones LOH neutras en LMA ................... 73 2.2. Detección de patrones complejos de número de copia y LOH....... 75 2.3. Combinación de herramientas genómicas en la búsqueda de genes candidatos en LMA...................................................................................... 76 2.3.1. Genes candidatos en el cromosoma 17...................... 76 VIII 2.3.2. Validación independiente mediante FISH de la deleción de NF1 ............. 78 2.3.3. Cuantificación mediante inmunohistoquímica de los niveles de neurofibromina tras la deleción de NF1 .............................................................. 78


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