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http://hdl.handle.net/10261/54512
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Título: | Identificación y cuantificación de especies del género Merluccius mediante la utilización de PCR a tiempo real |
Autor: | Sánchez, Ana Cristina CSIC ORCID | Director: | González Sotelo, Carmen CSIC ORCID; Quinteiro, Javier | Fecha de publicación: | 3-ago-2012 | Resumen: | Desde los años 60 se ha venido planteando la resolución de la problemática
del correcto etiquetado de las especies pesqueras presentes en la amplia variedad
de los productos de la pesca y como abordar la aplicación de protocolos de
trazabilidad en este tipo de productos. Con este fin se han desarrollado normativas
específicas para el etiquetado de los diversos productos comerciales de pescado. A
lo largo de los años las normativas se han ido modificando de manera que no sólo
incluyen la regulación del etiquetado de las especies, esto es, la identificación de
las especies presentes en el producto, sino también la obligatoriedad de incluir en
el etiquetado la cantidad de cada una de las especies empleadas en el producto.
La necesidad de cumplir con estos requerimientos legales hace necesario disponer
de técnicas de autentificación para los productos pesqueros. La técnica más
sencilla de autentificación de especies de pescado es la inspección visual. Este tipo
de identificación presenta el inconveniente de que sólo se puede realizar en
ejemplares que presenten sus caracteres morfológicos intactos. Sin embargo, cada
vez es mayor la cantidad de productos procesados carentes de caracteres
morfológicos que permitan su identificación. En los últimos años los métodos más
aplicados en la identificación de especies en alimentos se basan en el análisis de
ADN. En la actualidad se ha incorporado la técnica de la PCR a tiempo real a esta
práctica, ya que presenta la ventaja de permitir una identificación de especies en
productos donde hay más de una especie. En la PCR a tiempo real es posible la
monitorización continua de todo el proceso de amplificación gracias a la
incorporación de un elemento de emisión de fluorescencia, por lo que es posible
comparar distintas muestras en función de la fase exponencial, cuando la
eficiencia es máxima, en vez de a punto final como ocurre con la PCR convencional.
El fundamento de la PCR a tiempo real radica en la existencia de una correlación
entre la señal de fluorescencia emitida durante el proceso de la PCR y la cantidad
de ADN molde (diana para esa PCR). Existen distintos métodos matemáticos que
transforman esa señal de fluorescencia en datos de cuantificación absoluta o
relativa del fragmento de ADN amplificado. Por lo tanto con esta técnica es posible
tanto la identificación de una especie como su cuantificación. En esta memoria se
describe el diseño de distintos sistemas de PCR en tiempo real (sondas TaqMan-
MGB) específicos de las especies más importantes desde el punto de vista comercial del género Merluccius y Macruronus, empleando para ello alineamientos de secuencias mitocondriales y nucleares. Del mismo modo se aplicaron distintas ecuaciones sigmoideas para el ajuste del perfil de datos de fluorescencia obtenidos en cada una de las reacciones de PCR, obteniendo el mejor ajuste con la ecuación de Richards con 4 parámetros. A partir de dicha ecuación se seleccionó el parámetro c como sustituto del valor Ct, método “Threshhold”, por ser menos sensible al error experimental. Una vez descritos los perfiles cinéticos se llevó a cabo la evaluación de la eficiencia y la capacidad identificativa (especificidad) de seis de los sistemas TaqMan-MGB diseñados. Se obtuvieron buenos resultados de especificidad para la mayoría de los sistemas a excepción del sistema MMER, uno de los dos sistemas diseñados para la especie M. merluccius ya que presentó reacción cruzada con la especie M. capensis. La aplicación del sistema MMER_VIC, específico de la especie M. merluccius, en muestras comerciales permitió discriminar las muestras M. merluccius de las que no lo eran sin obtener falsos positivos. Posteriormente, se evaluó la capacidad cuantitativa, tanto relativa como absoluta, de cuatro sistemas, tres de género (MAC, HAKE y MLL) y uno especieespecífico (MMER_VIC) en mezclas modelo de diversa complejidad obteniendo unos resultados de cuantificación ajustados de manera significativa a lo esperado, tanto en cuantificación absoluta como relativa e independientemente de la complejidad de las muestras. |
Descripción: | 327 páginas | URI: | http://hdl.handle.net/10261/54512 |
Aparece en las colecciones: | (IIM) Tesis |
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