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Role and regulation of the novel splicing variants sst5tmd4 and in1-ghrelin in breast cancer

  • Autores: David Rincón Fernández Pacheco
  • Directores de la Tesis: Manuel David Gahete Ortiz (dir. tes.), Justo P. Castaño Fuentes (dir. tes.)
  • Lectura: En la Universidad de Córdoba (ESP) ( España ) en 2016
  • Idioma: español
  • Tribunal Calificador de la Tesis: Rául Miguel Luque Huertas (presid.), Gema Moreno Bueno (secret.), Corinne Bousquet (voc.)
  • Materias:
  • Enlaces
    • Tesis en acceso abierto en: Helvia
  • Resumen
    • 1. Introducción o motivación de la tesis El cáncer, en sus múltiples formas, es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la sociedad actual [1, 2]. Una de las mayores limitaciones en la investigación del cáncer es la gran heterogeneidad existente entre las diferentes patologías tumorales e incluso entre pacientes con un mismo tipo de cáncer [3]. A pesar de esto, estudios recientes han definido un conjunto de características comunes compartidas por los diferentes tipos de cáncer [4, 5] entre los que se encuentran la alteración del splicing alternativo [6]. En concreto, el splicing alternativo es un mecanismo molecular por el que los organismos eucariotas pueden aumentar exponencialmente la cantidad de transcritos diferentes partiendo de un mismo genoma, a través de la reorganización de los diferentes elementos (exones e intrones) que componen los genes [7].

      Entre las diferentes patologías tumorales, llama especialmente la atención el cáncer de mama ya que constituye uno de los tipos de cáncer más importante en términos de incidencia tumoral pero también en términos de mortalidad [1]. Este tipo de cáncer también se caracteriza por una desregulación de los procesos de splicing alternativo y, por lo tanto, por un perfil alterado de ciertas variantes de splicing [8]. Así, nuestro grupo de investigación ha identificado la presencia de determinadas variantes de splicing de los ejes neuroendocrinos constituidos por las hormonas somatostatina (SST), cortistatina (CORT) y ghrelina y sus receptores (ssts y GHSRs), especialmente la variante de splicing In1-ghrelina [9] y el receptor truncado sst5TMD4 [10], en este tipo de patologías.

      En concreto, la variante de splicing del receptor 5 de SST denominada sst5TMD4 codifica un receptor truncado de 4 dominios transmembrana (TMDs) que está sobreexpresado en diversos tipos tumorales (tumores hipofisarios [10-12] y neuroendocrinos [13], así como en cáncer de tiroides [14] y de mama [15]), mientras que su expresión en tejidos sanos es muy reducida o nula [10]. Además, la expresión del sst5TMD4 en estas patologías se asocia con una mayor malignidad tumoral, con una menor respuesta al tratamiento con análogos de SST y con un peor pronóstico clínico [10-15]. Por otro lado, la In1-ghrelina, descubierta recientemente por nuestro grupo y que se genera gracias a un proceso de retención intrónica, presenta importantes implicaciones patológicas en tumores hipofisarios [16], neuroendocrinos [17] y de mama [9] donde se ha encontrado sobreexpresada y asociada a procesos de malignización tumoral.

      Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en la regulación de la expresión de sst5TMD4 e In1-ghrelina, así como el papel preciso y las implicaciones clínicas de estas variantes de splicing en cáncer de mama no se han explorado aún con suficiente detalle. Por este motivo, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral era profundizar en el conocimiento de los sistemas y/o mecanismos de regulación que determinan la expresión diferencial de las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina, así como el papel y las implicaciones clínicas que ambas variantes juegan en la fisiopatología del cáncer de mama. Para alcanzar este objetivo general se planteó el estudio de estas variantes de splicing desde una perspectiva multidisciplinar que incluyera estudios sobre muestras humanas, modelos preclínicos de ratón, líneas celulares y aproximaciones moleculares in vitro e in silico.

      2. Contenido de la investigación De esta manera, los estudios realizados sobre el receptor truncado sst5TMD4 demostraron que la modulación de su expresión está bajo el control preciso de un complejo e intrincado sistema de elementos reguladores entre los que se incluyen la presencia de polimorfismos de nucleótido único (SNPs), la acción de determinados factores de splicing o la interacción con ciertos miRNAs. En concreto, a través del estudio de la variabilidad poblacional en la secuencia genómica del gen SST5, observamos la presencia de dos SNPs en el intrón críptico eliminado Duránte la generación del sst5TMD4, los cuales mostraron claras diferencias en cuanto a las frecuencias alélicas entre muestras tumorales y no tumorales y entre aquellas con alta y baja expresión del receptor truncado sst5TMD4 entre las muestras tumorales. Además, estudios in silico sobre la presencia de dianas para factores de splicing dentro de la secuencia del gen SST5 demostraron la existencia de una alta densidad de secuencias para factores inhibidores del splicing en el intrón críptico en comparación con el resto de la secuencia génica, lo que sugiere un papel relevante de estos factores en la modulación del splicing de este intrón. Por último, estudios in silico sugirieron el posible papel de ciertos miRNAs en la regulación de la expresión del sst5TMD4. Entre ellos, el hsa-miR-346 mostró una correlación negativa con los niveles de expresión del sst5TMD4 en una batería de muestras de mama. Además, estudios in vitro mostraron que el hsa-miR-346 es capaz de modular la expresión de sst5TMD4, sugiriendo un papel central de este miRNA en la regulación de la expresión del sst5TMD4.

      Desde el punto de vista funcional, realizamos un array de expresión con el objetivo de identificar los mecanismos moleculares subyacentes al aumento de la malignidad tumoral asociada a la expresión del sst5TMD4 que demostró que la sobreexpresión de este receptor truncado está asociada a una fuerte desregulación de multitud de genes relacionados con el proceso de angiogénesis. Estudios más profundos demostraron que el receptor sst5TMD4 es capaz de aumentar la expresión de factores pro-angiogénicos como VEGF, EGF o Angiopoietina-1 en modelos in vitro e in vivo (modelos preclínicos de ratón), en los que además se correlacionó con una mayor vascularización tumoral. Además, la presencia del sst5TMD4 incrementó la desdiferenciación celular y la formación de mamosferas in vitro. Más aún, la expresión de sst5TMD4 se correlacionó con marcadores de angiogénesis en muestras humanas de cáncer de mama y con mayor incidencia de metástasis. Por último, la alta expresión del receptor sst5TMD4 en muestras de cáncer de mama se asoció a menor supervivencia libre de enfermedad, lo que refuerza la idea de una importante asociación entre el sst5TMD4 y un peor pronóstico en cáncer de mama.

      Por otro lado, con la finalidad de profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la expresión de la In1-ghrelina, analizamos la variabilidad genómica del gen de la ghrelina, centrándonos en la región del intrón retenido para la generación de la In1-ghrelina. Sorprendentemente, estos estudios no detectaron variaciones entre las diferentes muestras analizadas. Además, estudiamos in silico la presencia de dianas para factores de splicing en la secuencia del gen de la ghrelina, encontrando una proporción equilibrada de secuencias diana para factores de splicing inhibidores y estimuladores, entre los que destacan SRSF5 y hnRNP H1, por situarse en regiones del intrón conservadas entre diferentes especies. Por último, también se exploró el posible papel de los lncRNAs codificados por el gen antisentido de la ghrelina, GHRLOS. A través de este estudio se determinó que tres de las variantes de splicing del gen GHRLOS presentan patrones de expresión comparables a los de In1-ghrelina, pero no a los de ghrelina, lo que sugiere un posible efecto regulador específico de estos lncRNAs sobre la expresión de In1-ghrelina.

      Con el motivo de estudiar el papel de la In1-ghrelina en la malignidad tumoral en cáncer de mama y los mecanismos celulares asociados, se estudiaron in vitro diferentes características tumorales en relación con la presencia de In1-ghrelina, demostrando que esta variante de splicing, pero no la ghrelina nativa, aumenta la capacidad de proliferación y migración, probablemente a través de un aumento en la señalización a través de MEK/ERK. Estos estudios fueron confirmados por medio de ensayos de reducción de la expresión endógena de In1-ghrelina que produjeron una disminución en ambas capacidades. Adicionalmente, comprobamos que la sobreexpresión de In1-ghrelina, pero no de ghrelina, promueve un estado de mayor desdiferenciación representado por un aumento de la plasticidad celular y de la capacidad de formar mamosferas, y por tanto, del porcentaje de células madre tumorales (CSCs). Estos cambios parecen deberse, en parte, a la inducción de las rutas de señalización Jag1/Notch y Wnt/-catenina. Además, estas capacidades funcionales observadas in vitro son probablemente la base de las correlaciones clínicas determinadas en muestras de cáncer de mama. Específicamente, hemos comprobado que una mayor expresión de In1-ghrelina correlaciona con un aumento de la aparición de metástasis en nódulos linfáticos así como con la disminución de la esperanza de vida libre de enfermedad de pacientes de cáncer de mama.

      3. Conclusión Por todo ello, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral sobre la regulación de la expresión y el papel patológico de las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina en el contexto del cáncer de mama, refuerzan la relevancia de la desregulación del proceso de splicing alternativo en el desarrollo y progresión tumoral. Específicamente, nuestros hallazgos demuestran que ambas variantes de splicing inducen importantes alteraciones en esta patología tumoral y podrían representar potenciales dianas terapéuticas relevantes para el cáncer de mama.


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