ES2402726B1 - Nueva cepa de bacillus subtilis destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas. - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a una cepa aislada de de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSM con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, y también depositada en la Colección de Cultivos Tipo Española con número de acceso CECT 7254, propiedad de la empresa que presenta la patente, donde dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y antibacteriana, con un perfil de acción diferente al de otras cepas de Bacillus subtilis, y con una potencia mucho mayor en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en campo. La invención incluye también métodos de prevención y tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas usando dichas cepas bacterianas o sobrenadantes que contienen antibióticos o antibióticos puros obtenidos de dichas cepas bacterianas, donde dichos antibióticos están contenidos en una composición.

Description

NUEVA CEPA DE BACILLUS SUBTILlS DESTINADA A LUCHAR CONTRA LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS.
La presente invención se enmarca en el campo de los biopesticidas. Más concretamente, esta invención se relaciona con el descubrimiento de una nueva
cepa de Bacillus subtilis, (IAB/BS03), que puede inhibir un amplio abanico de
enfermedades fúngicas y bacterianas de plantas. La invención se relaciona también con composiciones fungicidas que contienen esta nueva cepa de Bacillus subfi!is, bien sola, bien como parte de una formulación, o bien en combinación con
otros pesticidas quimicos y biológicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Se sabe que diversos microorganismos exhiben actividad biológica y son útiles en el control de enfermedades de las plantas. Aunque se han hecho progresos en el
campo de la identificación y el desarrollo de pesticidas biológicos para controlar
diversas enfermedades de plantas de importancia agronómica, como los frutales y diversos productos hortícolas, la mayor parte de los pesticidas en uso son aún compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados como carcinógenos en nuestra actual reglamentación Europea, y también en la
EPA, y han demostrado ser tóxicos para la vida salvaje y otras especies que no
son su objetivo. Además, estos compuestos químicos de síntesis, producen en muchísimos casos un fenómeno de resistencia, con lo que elllos patógenos tratados repetidamente con estos compuestos, acabarán siendo inmunes y
resistentes al tratamiento, con lo que el control sobre la plaga o enfermedad dejará de ser efectivo (Schwinn y col., p.244, Advances in plant pathology: phytophthora infestans, the cause of late blight of patato (Academic Press, San Diego, 1991).
Se ha descrito la actividad biológica de distintos tipos de microorganismos frente a
enfermedades y plagas de las plantas. En concreto se ha descrito ciertas cepas
de Bacillus spp (Bacillus spp. incluye B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis, entre otros) que exhiben actividad frente a diversas plagas del campo (Stabb y col. (1990), Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412). Esta actividad, puede ser
debida a distintos mecanismos de acción, entre los que se encuentran la
producción de antibióticos que inhiben el desarrollo de hongos y bacterias, o la
producción de toxinas que actúan de forma especifica y selectiva contra determinadas clases de insectos.
En las patentes en EEUU N° 4999192 Y N° 5208017 se describe que las cepas
pesticidas de B. thuringiensis producen proteinas cristalinas durante la esporulación, que son específicamente tóxicas para ciertos ordenes y especies de insectos y nematodos.
En general, Bacillus subtilis y sus especies cercanas se consideran
microorganismos no patógenos, aceptados como GRAS (Generally Regarded As Safe), por la US Food and Drog Administration (US EPA). Sin embargo, es dificil
caracterizar una especie de Bacillus subtilis, para poder diferenciarla de otras especies como Bacillus cereus o de Bacillus thuringiensis. Bacillus cereus es una especie cercana a Baci/lus subti/is, pero que sin embargo causa gastroenteritis e infecciones oportunistas cuando se encuentra como contaminante en la cadena alimentaria. Bacillus thuringiensis es un microorganismo ampliamente utilizado como bioinsecticida, sin embargo su espectro de acción en cuanto a plagas
(insectos) es muy diferente de Bacillus subtilis, cuyo espectro de acción serian, preferentemente, los hongos fitopatógenos.
Existen numerosos documentos de patente , basados en cepas de Bacillus cereus.
La Patente en EEUU N° 5049379 de Handelsman y col. describe el revestimiento de semillas con una cepa especifica de Bacillus cereus (ATCC 53522), inhibiendo la actividad patogénica del hongo de la podredumbre de la raiz. También describe
cómo la aplicación de formulaciones basadas en esporas de ciertas cepas de Bacillus cereus aplicadas a semillas de soja o al suelo que rodea las semillas,
mejora el rendimiento de la soja (Osburne y col. (1995), Am. Phy1opathol. Soco 79(6); Smith y col. (1993)).
En el estado de la técnica, también se ha descrito que la actividad del hongo patógeno de suelo, Pythium aphanidermatum, en el cultivo de pepino, puede ser suprimida usando la cepa UW de B. cereus (Plant Disease 77(2), 139-142).
El espectro de acción de los distintos Bacillus, viene determinado, no solo por la especie, sino también, por la cepa concreta que se esté estudiando. Además, el uso de especies como Bacillus cereus o de Bacillus thuringiensis como agentes
de biocontrol no seria adecuada debido a la caracteristica de ser un contaminante
de alimentos, prohibida su presencia en la cadena alimentaria.
En cuanto al Bacillus subtifis y otras especies muy cercanas (B. pumilus, B.
polymyxa, B. megatherium, etc.), también existen numerosas referencias
bibliográficas y documentos de patentes que hacen referencia a su efecto antifúngico por producción de antibióticos (Leifert y col. (1995), J. Appl. Bacteriol.
78: 97-108, Astilbe; Leifert y col. (1997) Patente en EEUU N° 5.597.565; Rossall (1994), Patente EE.UU. N° 5.344.647, Sholberg y col. (1995), Can. J. Microbiol.
41: 247-252; Swinburne y col. (1975), Trans. Brit. Mycol. Soco 65: 211-217; Singh y Oeverall (1984), Trans. Br. Mycol. Soco 83: 487-490, y Ferreira y col. (1991), Phytopathology 81: 283-287).
Se ha descrito el uso de Bacillus spp. y de Bacillus subtilis como agentes de biocontrol de patógenos fúngicos de plantas (Baker y col. (1983), Phytopathology
73: 1148-1152, Pusey y col. (1988), Plant Ois. 72: 622-626; Pusey y Robins (Patente EE.UU. N° 5.047.239) Y McKeen y col. (1986), Phytopathology 76: 136139).
Es decir, que la actividad fungicida, por producción de antibióticos de distintas cepas de Bacillus subtilis y otras especies cercanas, es algo que está ampliamente documentado. Incluso se encuentran los registros de esta producción de antibióticos, en concreto, del B. megaterium, por Berdy en el CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vol. I-XIV (CRC Press, Ine., Boca Ratón, FL, 1980-87).
Sin embargo, no se encuentran en el mercado productos comerciales en base a
cualquiera de los antibióticos producidos por las distintas cepas de Bacillus. Un
grupo de investigadores en base a su trabajo con una serie de cepas de Bacillus
productoras de iturinas (antibiótico producido por cepas de Baeillus), afirman que
las cantidades de iturinas obtenidas de producción natural son inadecuadas para
ser comercialmente viables (Bland col. (1995), Proc. Plant Growth Regulation Soco Am. 22': 105-107)). Por este motivo, las aplicaciones en campo se hacen con
formulaciones sólidas o líquidas que contienen esporas de los bacilos, y que ejercen su acción una vez comienzan su desarrollo en el nicho ecológico que se les ofrezca, siempre y cuando tengan los requisitos necesarios para reproducirse.
ES2268774 y EP0981540B1 describen la cepa de Bacilfus subtilis AQ713, idéntica a la cepa QST 713, como una cepa productora de antibióticos y metabolitos que exhibe una amplia actividad fungicida y bactericida. Este documento de patente describe el uso de dicha cepa en un método de tratamiento
o de protección de las plantas y frente a infecciones fúngicas y bacterianas.
Actualmente, dicha cepa se comercializa en forma de polvo mojable o humectable, es decir, lo que se comercializa es la forma de resistencia de dicha
cepa , la espora de Baciflus subtifis QST 713. Sin embargo, Bacilfus subtilis cepa QST 713 no presenta actividad fung icida o no es lo suficientemente potente contra la enfermedad fúngica Mildiu de la lechuga (Bremia factucae), por lo que su
aplicación en tratam ientos o protección de plantas no es del todo eficaz. En el ejemplo 4 de la presente invención, se emplea un producto comercial con Bacillus
subtifis cepa QST 713, y se compara su eficacia como agente fung icida comparada con la cepa de Baciffus subtifis objeto de la presente invención, contra la enfermedad fúng ica Mildiu de la lechuga (Bremia factucae). En el ejemplo 8, párrafo 55 de la patente ES2268774 y EP0981540B1 , se observa que la cepa QST 713 no previno el añublo velloso (mildiu o Bremia de la lechuga), mientras que la cepa de Baciffus subtifis objeto de la presente invención, si tiene efecto contra esta enfermedad. Cabe resaltar que adicionalmente la cepa de Baciffus
subtilis objeto de la presente invención presenta los mismos niveles de eficacia
que un fungicida quimico comercial, macozeb + cimoxamilo 4% (CURTAZE M), utilizándose a una dosis 300 veces menos que la dosis aplicada de Baciffus subtifis cepa OST 713.
Por tanto, actualmente existe la necesidad de identificar una cepa de Bacillus
subtifis diferente a Baciffus subtifis cepa QST 713, con distinta actividad
bactericida y fungicida , para su uso como biopesticida en el tratamiento y/o
protección de las plantas frente a infecciones de patógenos, preferentemente frente a infecciones de hongos fitopatógenos, y más preferentemente, contra el mildiu de la lechuga.
BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
La presente invención hace referencia a una cepa de Bacillus subtilis diferente a otras cepas concretas de Bacillus subtilis que actualmente están disponibles en el mercado (como por ejemplo Bacillus subtifis cepa QST 713), y que presenta actividad bactericida y/o fungicida, caracterizada porque los antibióticos que producen poseen una gran potencia y además su combinación produce diferentes especificidades frente a las enfermedades de las plantas. Dicha cepa de Bacillus subtilis se usa en un método de tratamiento o de protección de las plantas frente a infecciones tú ngicas y/o bacterianas que consiste en aplicar una cantidad efectiva de la misma, caracterizada por ser menor a la necesaria para otras cepas de Bacillus subtilis actualmente disponibles en el mercado (como por ejemplo Bacillus subtilis cepa QST 713).
La cepa de Bacillus subtifis objeto de la presente invención puede presentarse en cualquiera de las formas conocidas por un experto en la materia: en forma de espora, bien en formulación sólida, granulado o liquido, como cultivo activado, o incluso como el sobrenadante de la suspensión de este cultivo activado, donde estén presentes los meta bolitas producidos, etc.
DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN
Cepa Bacillus subtilis (DSM 24682)
La siguientes cepa ha sido depositada el 06 de junio de 2011 , en la Colección de Cultivos Tipo Alemana (DSMZ), Inhoffenstralle 7 B, 38124 Braunschweig (Alemania), por Dña. Estefania Hinarejos Esteve, IAB, S.L. (Investigaciones y Aplicaciones Biotecnológicas S.L.), Avda. Paret del Patriarca 11-B, Ap.30, 46113 Moneada, Valencia (España).
El depósito de la cepa depositada cuya referencia es Bacillus subtilis Yi!L subtilis designada como IAB/BS03, CECT 7254, fue identificado por la DSMZ con el número de acceso DSM 24682 una vez dicha Autoridad Internacional para el Depósito declaró que dicha cepa en cuestión era viable, bajo las estipulaciones
del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos con Fines de Procedimiento de Patente.
La cepa DSM 24682 de Baciflus subtilis presenta una amplia actividad antifúngica, más potente que otras cepas de Baciflus subtilis, frente a determinadas enfermedades. La cepa DSM 24682, se identifica como una cepa de Baeillus subtilis diferenciable de otras cepas, no solo de Bacillus spp. (B. cereus y B. thuringiensis) , sino también de otras cepas de Baeillus subtilis ampliamente caracterizadas y documentadas, como Baeillus subtilis cepa QST 713. Ambas
cepas son productoras de sustancias antibióticas frente a hongos fitopatógenos, pero la cepa DSM 24682 es más potente en cuanto a la especificidad y selectividad de los tratamientos, y en cuanto a su eficacia. La presente invención permite controlar completamente el ataque patógeno con tan solo una pequeña aportación del citado microorganismo. Lo que demuestra que con el mismo número de aplicaciones de dicha cepa , y con una concentración de trabajo menor que la que actualmente se encuentra en el mercado como fitosanitario, presenta
igual eficacia que un producto químico de sintesis para ese determinado uso y
comparada con otra cepa de la misma especie.
La presente invención tiene como objeto de protección una cepa aislada de
Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, y también
depositada en la Colección de Cultivos Tipo Española con número de acceso
CECT 7254, propiedad de la empresa que presenta la presente invención, donde
dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y/o antibacteriana.
Preferentemente, dicha cepa presenta un perfil de acción diferente al de otras cepas de Baci/lus subti/is, y al menos 300 veces más potente en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en campo.
En una realización preferente de la presente invención , se protege la cepa anteriormente descrita , caracterizada porque es la cepa de Bacillus subtilis
IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682.
En otra realización preferente de la presente invención , se protege un cultivo
activo (fermentación) en caldo completo de la cepa descrita anteriormente.
En otra realización preferente de la presente invención , se protege un sobrenadante obtenido de un cultivo de la cepa descrito anteriormente caracterizado porque exhibe actividad antifúngica y antibacteriana.
En otra realización preferente de la presente invención, se protege una composición que comprende al menos:
(i) la cepa descrita anteriormente;
(ii) el cultivo activo en caldo completo de la cepa; o
(iii) el sobrenadante descrito anteriormente; pudiendo contener también de manera preferente , un fungicida químico o un pesticida quimico o biológico.
En una realización aún más preferente , dicha composición además incluye o bien un fungicida quimico o bien un pesticida o plaguicida químico o biológico.
En otra realización preferente de la presente invención, se protege un método de
uso para la protección y/o tratamiento de plantas y frutos frente a infecciones fúngicas y/o bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de la cepa , del cultivo activo en caldo completo, del sobrenadante o de la composición,
descritos anteriormente.
Preferentemente, dicho método se caracteriza porque se administra al menos una dosis 300 veces menor de la cantidad efectiva de la cepa, del cultivo activo en caldo completo, del sobrenadante o de la composición, descritos anteriormente , para alcanzar la misma potencia fungicida que cuando se administra otra cepa de
Bacillus subtilis. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención es al menos 300 veces más potente que Bacilfus subtilis cepa QST 713, como ejemplo representativo de otra cepa concreta de la misma especie (de Bacillus subtilis). Además, la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente
invención, tiene propiedades fungicidas equiparables al tratamiento con macozeb
+ cimoxamilo 4% (CURTAZE M), como ejemplo representativo de un tratamiento
fungicida químico comercial.
En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque las infecciones fúngicas y/o bacterianas están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternaria sp, Botrytis
sp, Fusarium sp, Phytophthora sp, Rhizoctonia sp, Sc/erotinia sp, Verticilfium sp, Leveillu/a sp, Venturia sp, P/asmopara sp, Uncinu/a sp, pythium sp, Colletotrichum
sp, Cladosporium sp, Monilinia sp, Acidovorax sp, Pseudomonas sp,
Xanthomonas sp, Erwinia sp, C/avi-bacter sp, Sphaerotheca sp, y Peronospora sp.
Preferentemente, dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente
grupo: Altemaria sp, Botrytis sp, Fusarium sp, Phytophthora sp, Rhizoctonia sp, Sc/erotinia sp, y Vertici/lium sp.
Más preferentemente dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Altemaria solani, Altemaria brassiciola, Botrytis cinérea, Fusarium
oxysporum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia so/a ni, Sc/erotinia sc/erotorium, Vertici/lium /ecanii, Leveillu/a taurica, Venturia inaequalis, Venturia pyrina, P/asmopara vitícola, Uncinu/a necátor, Pythium u/timum, Colletotrichum cocodes,
C/adosporium cucumerinum, Moni/inia fructicola, Acidovorax avenae, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Clavi
bacter michiganense, Sphaerotheca fuliginea, y Peronospora parasitica.
Aún más preferentemente, dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Altemaria solani, Alternaria brassiciola, Botrytis cinérea, Fusarium
oxysporum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia so/ani, Sc/erotinia sc/erotorum, y
Verticillium lecanii.
En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque la
cepa es aplicada como polvos humectables, gránulos, fluidos o
microencapsu!aciones.
En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque la cepa, el cultivo activo en caldo completo, el sobrenadante o la composición descritos anteriormente, son aplicados en un sitio seleccionado de entre el
siguiente grupo: las raices, las hojas (parte vegetativa), las flores, los frutos y el
suelo alrededor de las raices.
En otra realización preferente de la presente invención, se protege una composición que comprende cualquiera de los antibióticos y metabolitos secundarios producidos por la cepa descrita anteriormente, o sus combinaciones.
La invención incluye también métodos de prevención y tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas usando dichas cepas bacterianas o sobrenadantes que contienen antibióticos o antibióticos puros
obtenidos de dichas cepas bacterianas, donde dichos antibióticos están
contenidos en una composición según se define en las reivind icaciones.
Dado que los efectos frente a dichas enfermedades fúng icas y bacterianas son diferentes a los descritos para Baciffus subtifis cepa QST 713 , es perfectamente entendible que la combinación de metabolitos producidos y/o antibióticos
producidos por la cepa en cuestión, son diferentes. cualitativa y cuantitativamente
(cepa diferenciable y efectos diferentes claramente medibles).
Tal como se usa aqui, "control biológico" se define como control de un patógeno
mediante el uso de un segundo organismo. Los mecanismos conocidos de control
biológico incluyen bacterias y hongos que son capaces de controlar enfermedades tanto de raiz, como de la parte foliar de las plantas. Se utilizan de
estas bacterias y hongos, o bien las toxinas o metabolitos secundarios producidos
y aislados, o bien la especie fúngica y/o bacteriana, aplicada in situ, para que
dichas toxinas y metabolitos sean producidos una vez la bacteria u hongo, encuentra lo necesario para su reproducción y desarrollo.
El término "hongo" u "hongos", incluye una amplia variedad de organismos portadores de esporas nucleados que están desprovistos de clorofila. Como ejemplos de hongos, se incluyen levaduras, mohos filamentosos y setas.
El término "bacteria" incluye cualquier organismo procariótico que no tenga un núcleo diferenciado.
El térm ino "fung icida o antifúngico" significa la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de los hongos.
El térm ino "bactericida" significa la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir el crecimiento de las bacterias.
El térm ino "antibiótico" incluye cualquier substancia que sea capaz de matar o inhibir un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o por un procedimiento sintético o un procedimiento semi
sintético. El término, por lo tanto, incluye una substancia que inhibe o mata hongos, por ejemplo la combinación de Iturinas, Surfactinas, Plipastatinas y otros antibióticos, producidos por diferentes cepas de Baeillus.
El término "cultivo" se refiere a la propagación de organismos sobre o en medios de varios tipos. "Cultivo en caldo completo" se refiere a un cultivo liquido que
contiene tanto células como med io. "Sobrenadante" se refiere al caldo líquido que queda cuando se separan las células que han crecido en caldo por centrifugación, filtración , sedimentación u otros medios bien conocidos en la técnica.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos de tratamiento y protección , una "cantidad efectiva" es aquella cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir,
enlentecer O retrasar la progresión de los estados de la enfermedad fúng ica o bacteriana.
El término "control positivo" significa un compuesto que se sabe tiene actividad
pesticida. "Controles positivos" incluye, aunque sin limitación, pesticidas quimicos
comercializados. El término "control negativo" significa un compuesto que se sabe
no tiene actividad pesticida. Son ejemplos de controles negativos el agua o el acetato de etilo.
El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, substancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo que tenga actividad pesticida. Antibiótico, según se define aqui, es un metabolito específicamente activo contra un microorganismo.
Otra realización de la presente invención proporciona un método de tratamiento o protección de las plantas frente a infecciones fúng icas y bacterianas, consistente en aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo en
caldo completo de DSM 24682 dentro de la presente invención. El sobrenadante
puede ser obtenido por medios bien conocidos en la técn ica, incluyendo centrifugación , filtración, sedimentación y similares.
Con objeto de conseguir una buena dispersión y adhesión de composiciones en la presente invención, puede ser ventajoso formular el cultivo en caldo completo, el
sobrenadante y/o el metabolito/antibiótico con componentes que ayuden a la dispersión y a la adhesión. Las formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.
Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como polvos humectables, gránulos y similares, o pueden ser microencapsuladas en un medio
adecuado y similar. Como ejemplos de otras formulaciones, se incluyen, aunque
sin limitación, polvos solubles, gránulos humectables, fluidos secos, fluidos acuosos, gránulos dispersables humectables, concentrados emulsionables y suspensiones acuosas. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y
caracteristicas de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se
proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
FIGURA 1. A Y B. Caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), donde se demuestra la diferenciación de la cepa particular de Bacil/us subtilis,
frente a otras como Bacillus lhuringiensis y Bacillus cereus.
FIGURA 2. Perfil genético de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a la cepa QST 713, donde se demuestra específicamente que la similitud que existe entre ambas es solo de 0.24, y que por tanto, son cepas diferentes de Bacillus sub/ilis.
FIGURA 3. A Y B. Resultados visuales del efecto fungicida de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a Alternaria sp. y frente a Fusariurn oxysporum, respectivamente, se testa en concreto la capacidad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de actuar como agente de biocontrol, frente a Al/emana sp y Fusarium
oxysporum.
FIGURA 4. Eficacia de los tratamientos 1-5 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacil/us sub/ilis contra la enfermedad fúng ica Bremia lac/ucae, o mildiu de la lechuga.
FIGURA 5. Eficacia de los tratamientos 6-10 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03)
de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúng ica Bremia lactucae, o mildiu de la
lechuga.
FIGURA 6. Eficacia de los tratamientos 11-15 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03)
de Baciflus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga. FIGURA 7 A. Eficacia de los tratamientos 16-17 con la cepa DSM 24682 5 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga. B. Datos adicionales. FtGURA 8. A. B. Descripción del sitio de estudio. 10 FIGURA 9. A. B. Descripción de los tratamientos. FIGURA 10. Valoración de resultados.
FIGURA 11. A. B. Descripción de las eficacias. 15
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EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos
se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Los ejemplos que se proporcionan a continuación, constatan y demuestran que el
objeto de protección de la presente invención comprende: una cepa caracterizada, y que esa cepa es única y diferenciable de otras, de la misma especie ,
que esa cepa tiene capacidad de ser agente de control biológico, pues
como se ve en los ensayos in vitro, presenta acción frente a distintos
hongos patógenos,
que esa cepa tiene un espectro de acción diferente a otras (como por
ejemplo) Bacillus subtilis cepa QST 713, tal y como se demuestra en los
ensayos llevados a cabo en lechuga, para combatir la Bremia lactucae, o
mildiu de la lechuga, la QST 713, según nombran en ES2268774 y EP0981540B1 no presenta efecto frente a Bremia lactucae, mientras que la cepa objeto de la presente
invención, sí. Esto indica un espectro de acción diferente, y
que la cepa objeto de la presente es hasta 300 veces más potente que Bacillus subtilis cepa QST 713, pues según se muestra en los ejemplos, es capaz de combatir dicha enfermedad (Bremia lactucae), al igual que lo
hace un químico de síntesis (macozeb + cimoxamilo 4%), utilizando una
dosis al menos 300 veces menor, que la que se emplea con la cepa QST
713.
EJEMPLO 1. Caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) Se ha realizado un análisis "RiboPrint"de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03),
mediante el empleo de la enzima de restricción EcoRI , obteniendo los siguientes
resultados:
A. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) fue identificada como una cepa de Bacillus subtilis en base a la entrada DUP-12544 en la Libreria de Identificación DuPon!. Dicho patrón se basa en la cepa DSM 449.
B. El patrón de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) difiere significativamente de los patrones de otros tipos de cepas como Bacillus thuringiensis DSM 2046 T (únicamente se obtiene un indice de similitud DuPont ID del 0.17) y de Bacillus cereus DSM 31 T (indice de similitud del 0.15) (ver Figura 1 A). Bacillus
lhuringiensis y Bacillus cereus no son diferenciables en base a los patrones
EcoRI.
C. Por tanto, con la intención de demostrar la diversidad de los patrones EcoRI de Bacillus subtilis, las cepas DSM lOT, DSM 1970 y DSM 2109 se incluyeron en los ensayos de la comparación (ver Figura 1 B). El patrón de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) está claramente diferenciado de dichas cepas, ya que se obtienen los siguientes indices de similitud: 0.78 respecto a DSM 10T , 0.56 respecto a DSM 2109. Sin embargo es similar a la cepa DSM 1970, con un indice del 0.94 y a la cepa DSM 449 con un indice de 0.94. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) y la cepa DSM 1970 comparten un mismo RiboGroup ECORl 1982445-S-5, lo que indica que el sistema RiboPrinter es incapaz de detectar diferencias entre los patrones EcoRI de ambas cepas. En este ejemplo, se demuestra las diferencias entre los patrones EcoRI de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) respecto a otras cepas de Bacillus subtilis, con la excepción de la cepa DSM 1970, con la que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) comparte el mismo RiboGroup ECORl 198-2445-S-5.
Así mismo, indicar que las lecturas de los escaneados del ejemplo 1, el número
de entrada de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) es el 10-1079, mientras que el de la banda QST 713, es el 11-196.
Conclusión: La caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), demuestra la diferenciación de dicha cepa particular de Bacillus subtilis, frente a
otras como Bacillus thuringiensis y Bacillus cereus.
EJEMPLO 2. Comparación de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a la cepa QST 713.
Se realizó un perfil genético de la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) frente a Bacillus subtilis cepa OST 713, donde se demuestra especificamente que la similitud que existe entre ambas es solo de 0.24, y que por tanto, son cepas diferentes de Bacillus subtilis. Siguiendo el mismo método descrito en el ejemplo 1, se obtuvo un indice de similitud OuPont ID del 0.24 (ver Figura 2).
Conclusión: Los resultados del perfil genético demuestran que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), es una cepa distinta que Bacillus subtilis cepa OST 713, ya que el ind ice de similitud OuPont ID que se obtiene es únicamente del 0.24. Para
mejor entendimiento que las lecturas de los escaneados del ejemplo 1, el número
de entrada de la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) es el 10-1079, mientras que en el ejemplo 2 el de la banda Bacillus subtilis cepa OST 713 , es el 11-196.
EJEMPLO 3. Estudio de la actividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a distintas enfermedades fúngicas in vitro.
Para determinar si la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) es efectiva in vitro, frente a distintos hongos cultivables en laboratorio se realizaron una serie de ensayos "in vitro" en los que se evaluó el potencial de la cepa OSM 24682 aislada como agente de control biológico, estudiando sus efectos frente a los hongos Altemaria solani, Botrytis cinerea, Fusarium oxisporum, Phytophthora spp., Rhizoctonia sola ni, Sclerotinia spp. y Verticillium spp.
Para los ensayos se llevó a cabo la medición cualitativa de la inhibición del
crecimiento de diversos hongos fitopatógenos frente a la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis. Se siembra a cada lado de las placas de POA un Bacillus subtilis OSM 24682 (IAB/BS03) y en el centro al hongo patógeno. Se
hongo frente al testigo, en mm, y el % de antagonismo.
A continuación, se detallan los resultados (Tabla 1):
Tabla 1
Microorganismo
Alternaria
Bo/rytis
Fusarium
Phytoph/ora
Rhizoctonia
Sclerotinia
Verticillium
INHIBICION (mm)
10
10
5
3
6
6
9
Antagonismo (%)
67
94
60
70
24
37
42
Estos resultados, denotan que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus sub/ilis tiene producción de antibióticos que inhiben el crecimiento de distintos hongos,
10 por lo que puede utilizarse como agente de control biológico. Los resultados visuales del efecto frente a Alternaria sp. y frente a Fusarium oxysporum indican que existe una dism inución del crecimiento de Alternaria sp. del 59%, y de
Fusarium oxysporum del 60% (ver Figura 3A y 3B).
15 CONCLUSiÓN: Encontramos dos tipos de efecto inhibitorio de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus sub/ilis sobre los distintos hongos:
• Se produce antagonismo directo frente a Fusarium oxysporum, puesto que
se observó cómo en la zona de contacto, el hongo no era capaz de producir 20 micelio aéreo.
• Se observa también que se produce también una sustancia inhibitoria de crecim iento fúngico frente a Alternarla sp.
Por tanto se concluye que los resultados muestran que la cepa DSM 24682 25 (IAB/BS03) de Bacillus sub/ilis tiene un amplio espectro fungicida in vi/ro y que tanto el caldo completo como el sobrenadante podrían utilizarse para tal efecto,
puesto que se ha demostrado la producción de sustancias que inhiben el crecimiento y desarrollo de distintos hongos cultivables en laboratorio.
EJEMPLO 4. Análisis de la actividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de
Bacillus subtilis objeto de la presente invención frente a Bremia lactucae
(hongo fitopatógeno) y comparativa con el producto comercial Bacillus subtilis cepa aST 713.
En la patente EP O981 540 Bl se indica en el párrafo 55, ejemplo 8, que la cepa OST 713 (cepa A0713) no previno Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga, por lo que se ha analizado la efectividad de los tratamientos con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae (ver Figuras 4-7).
CONCLUSiÓN: Los resultados demuestran la efectividad de los tratamientos con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis objeto de la presente invención contra enfermedades fúngicas, como Bremia lactucae o mildiu de la lechuga, siendo estos iguales a los tratamientos químicos empleados, y obteniendo mejor resultado en cuanto a eficacia, que con otra cepa de Bacillus subtilis (OST 713). La cantidad de inóculo necesaria para obtener los efectos deseados, es mucho más baja, y por tanto la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Baci/lus subfi/is es una cepa mucho más potente.
Como explicación y referencia al contenido especifico de las Figuras 4-7, se comprueba mediante tratamiento estadístico, que las medias seguidas por la misma letra, no difieren significativamente, y que por lo tanto, los tratamientos pueden considerarse como con la misma eficacia, excepto en la columna 8 de las figuras 4,5,6 y 7, donde el tratam iento a base de la cepa OST 713, que se da a los 14 días de la última aplicación, es significativamente peor, y no comparable al tratamiento quimico de referencia (CURZATE M).
En el ejemplo al que hacemos referencia, se ha comparado Bacillus subtilis (OST 713) con calidad microbiana de 5,13Xl0IOCFU/g , mientras que el producto formulado con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), contiene 2,04X10' CFU/g (ver certificado de análisis adjunto (Tabla 2). El número de lote empleado en el ensayo, coincide con el número de lote del certificado de análisis incluido en la tabla 2.
Tabla 2. Certificado de análisis del producto formulado con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03).
SAM PLE BATC H RIUiIl...· . "brili. IAB/BSIOJ C ONTENT e) INTERNAL CODE FORMULATION ANALYS IS DATE e) Thc amounl (l f active ingrcdient descriOOl in lhe GLP study BTOn] 1.
Bac illus subtilis [ABIBSI03 WP fonnulation BS8J 101011 2.04 x lo' CFUfg 059/1 Jle WP 21 "' July2011 wa~ delcrm incoJ ~.;wrdi"g 10 Ihe vlIlidllled ~n!tlyti'-'lll 1ll<:lhod
Esto certifica que la aplicación del producto con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03)
objeto de la presente invención, se está haciendo con una calidad microbiana al menos, 100 órdenes por debajo com parado con el producto comercial Bacillus
subtilis cepa QST 713. Si se observan las dosis empleadas en cada aplicación
10 (referencia en cualquiera de las tablas), se aprecia que las dosis empleadas para el producto con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, ha sido de 100g/100L de agua, a 200g/100L de agua, mientras que las dosis empleadas para el producto comercial Bacillus subtifis cepa QST 713, ha sido de 600g. Es decir, las dosis empleadas para aplicar el producto comercial Bacillus
15 subtilis cepa QST 713, como ejemplo de cepa de B. subtifis, es 3 veces mayor
que la empleada con la máxima dosis para la aplicación del producto con la cepa
DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención.
Si a esto añadimos la diferencia de calidad microbiana, podemos afirmar que
20 aplicando una dosis 300 veces menor, para el producto que contiene la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, los resultados de control de Bremia lactucae o mildiu de la lechuga, son significativamente mejores, transcurridos 14 días desde la última aplicación. Es decir, que comparado con la cepa Bacilfus subtifis cepa QST 713, la cepa Bacilfus subtifis IAB/BS03 es al
25 menos 300 veces más potente y efectiva, en cuanto a su permanencia del efecto antifúngico en la planta.
Podemos concluir entonces, que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención es al menos 300 veces más potente que la cepa QST 713, como ejemplo representativo de otra cepa concreta de la misma especie (de Bacillus subtilis). Además, la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, tiene propiedades fungicidas equiparables al tratamiento con macozeb
+ cimoxamilo 4%, como ejemplo representativo de un tratamiento fungicida químico comercial.
EJEMPLO 5. Determinación de la eficacia y selectividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad de Moniliasis en frutas con hueso, con el fin de demostrar el efecto bactericida de la cepa.
Se determinó la eficacia y selectividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de
Bacillus subtilis contra la enfermedad de Moniliasis en frutas con hueso,
empleando una calidad microbiana de 10' UFC/g WP (ver Figuras 8-11). Al igual que en el ensayo anterior, la calidad microbiana que se utiliza de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) es menor (en este caso 100 veces menor) que la dosis efectiva del producto comercial Bacil/us subtilis cepa QST 713. En dicho ensayo, se emplea tebuconazol (FOLlCUR).
CONCLUSiÓN: En la Figura 11 se aprecia la eficacia del producto que contiene la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención en el tratamiento de ftores y brotes ante la enfermedad bacteriana Moniliasis en frutales de hueso. Una
vez realizado el tratamiento estadístico, se observan unos porcentajes de eficacia
del 74,8 al 82,9% en flores, y del 45,8 al 81,7% en brotes. Además, aparecen diferencias significativas frente al testigo (tesis sin tratar), con lo que queda demostrado, el efecto no solo fungicida, sino bactericida de la cepa.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Cepa de Bacillus subtifis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, donde dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y/o antibacteriana.
  2. 2. La cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta un perfil
    de acción diferente al de otras cepas de Bacillus subtilis, y al menos 300 veces
    más potente en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en campo.
  3. 3. La cepa según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque es la cepa
    de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682.
  4. 4. Un cultivo activo en caldo completo de la cepa descrita en las
    reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5. Un sobrenadante obtenido de un cultivo de la cepa descrita en las reivind icaciones 1 a 3, caracterizado porque exhibe actividad antifúngica y
    antibacteriana.
  6. 6. Una composición que comprende al menos:
    (i)
    la cepa descrita en las reivindicaciones 1 a 3;
    (ii)
    el cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 4; o
    (¡ti) el sobrenadante descrito en la reivindicación 5.
  7. 7. La composición según la reivindicación 6, que además incluye un
    plaguicida quimico o biológico.
  8. 8. Un método de protección o de tratamiento de plantas y frutos frente a
    infecciones fúngicas y/o bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de la cepa descrita en las reivindicaciones 1 a 3, del cultivo activo en caldo
    completo descrito en la reivindicación 4, del sobrenadante descrito en la reivindicación 5 o de la composición descrita en la reivindicación 6 y 7.
  9. 9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque se administra al
    5 menos una dosis 300 veces menor de la cantidad efectiva de la cepa descrita en
    las reivindicaciones 1 a 3, del cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 4, del sobrenadante descrito en la reivindicación 5 o de la composición descrita en la reivindicación 6 y 7; para alcanzar la misma potencia fungicida que cuando se administra otra cepa de Bacillus subfi!is.
  10. 10. El método según las reivindicaciones 8 y 9, donde las infecciones fúngicas
    y/o bacterianas están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de
    entre el siguiente grupo: Alternaria sp, Botrytis sp, Fusarium sp, Phytophthora sp, Rhizoetonia sp, Se/erotinia sp, Vertieillium sp, Leveillula sp, Venturia sp, iS Plasmopara sp, Uneinula sp, pythium sp, Golletotriehum sp, Gladosporium sp,
    Monilinia sp, Acidovorax sp, Pseudomonas sp, Xanthomonas sp, Erwinia sp,
    Glavi-baeter sp, Sphaerotheca sp, y Peronospora sp.
  11. 11. El método según las reivindicaciones 8 a 10, donde la cepa es aplicada como
    20 polvos humectables, gránulos, fluidos o microencapsulaciones.
  12. 12. El método según cualquiera de las reivind icaciones 8 a 11, donde la cepa
    descrita en las reivindicaciones 1 a 3, el cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 4, el sobrenadante descrito en la reivindicación 5 o la
    25 composición descrita en la reivindicación 6 y 7, son aplicados en un sitio seleccionado de entre el siguiente grupo: las raíces, las hojas, las flores, los frutos y el suelo alrededor de las raices.
  13. 13. Una composición que comprende cualquiera de los antibióticos y metabolitos
    30 secundarios producidos por la cepa descrita en las reivindicaciones 1 a 3, o sus combinaciones.
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