INTRODUCCIÓN

Las descripciones ultraestructurales del ovario, del proceso de ovogénesis y de la degeneración ovocitaria en bivalvos han aumentado, evidentemente, a partir de finales de la década de los 80’s, enfocándose casi exclusivamente en especies que tienen interés para su comercialización y consumo: Mytilus edulis (^{Pipe, 1987}), Pinna nobilis (^{de Gaulejac et al., 1995}), Crassostrea virginica (^{Eckelbarger & Davis, 1996}), Cyclina sinensis (^{Chung et al., 2007}), Spisula sachalinensis (Chung et al., 2008a), Sinonovacula constricta (Chung et al., 2008b) y Chamelea gallina (^{Erkan, 2009}).

Sin embargo, a pesar de que Spondylus limbatus es de gran importancia comercial en el Pacífico americano, y está bajo protección especial en México desde el año 2002 de acuerdo a los términos de la ley NOM-059 (Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales, 2010), hasta el momento no existe ningún estudio histológico o citológico de la gónada femenina de esta especie ni de ningún otro miembro de la familia Spondylidae.

Los estudios de ultraestructura ovocitaria en bivalvos generan conocimientos fundamentales acerca de los gametos, incluyendo morfología y tamaño. Asimismo, se abordan básicamente las variaciones que ocurren en cada especie, en particular la función de las células foliculares en la maduración gametogénica y los cambios que ocurren durante la degeneración ovocitaria (atresia) que se presenta dentro de alguna de las fases del ciclo gonádico de estos organismos (^{Beninger & Le Pennec, 1997}).

De la misma forma, los estudios de ultraestructura ovocitaria en bivalvos permiten llevar a cabo seguimientos específicos, con una gran capacidad de resolución, de las diversas alteraciones que pueden presentar los gametos de ejemplares sometidos a condiciones anómalas como la presencia de parásitos o procesos de contaminación medioambientales (^{Durfort et al., 1982}). De lo anterior, deriva la importancia de contar con descripciones previas de organismos provenientes de entornos saludables que funcionen como línea base para futuras comparaciones.

Por lo tanto, esta investigación tiene como objetivo caracterizar la morfología ultraestructural de los gametos femeninos maduros y en degeneración de Spondylus limbatus.

MATERIAL Y MÉTODO

En el Parque Nacional Bahía de Loreto, Golfo de California, México, se recolectaron durante la época reproductiva hembras adultas (>116 mm de altura de la concha, ^{Villalejo-Fuerte et al. (2002}), extraídas de Spondylus limbatus. Las gónadas de estos organismos fueron extraídas y se obtuvieron porciones de aproximadamente 5 mm, que fueron fijadas con glutaraldehido al 2,5 % (Electron Microscopy Sciences) en agua de mar filtrada (pH = 8) durante seis horas; transcurrido este tiempo se realizaron cinco lavados de diez minutos cada uno con solución amortiguadora de Sorensen. La post-fijación se realizó con tetraóxido de osmio al 1 % durante una hora y las muestras se lavaron con la solución amortiguadora de la misma forma. La deshidratación se realizó con una serie de soluciones de etanol de concentración ascendente (30 grados a absoluto). La infiltración de los tejidos se llevó a cabo con una solución de óxido de propileno y resina epóxica durante tres horas, para posteriormente incluirse con resina EPON 812. Se obtuvieron cortes ultra finos de 70 nm con ayuda de un ultramicrotomo, los cuales fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo. Finalmente, los cortes fueron examinados en un microscopio electrónico de transmisión Modelo JEM-1010 (60ky) y se obtuvieron micrografías de distintas porciones de la gónada.

Para caracterizar la morfología de los gametos femeninos maduros se obtuvieron medidas del diámetro total, del núcleo y del nucléolo y se seleccionaron distintas porciones celulares (núcleo, citoplasma y membrana citoplásmica) para analizar las estructuras específicas de cada región. En el caso de los ovocitos en degeneración, se observaron las características de la pérdida de la integridad celular en las mismas regiones que los ovocitos maduros viables.

RESULTADOS

Posición y morfología del ovario. Spondylus limbatus es una especie gonocórica que presenta un ovario discreto bien definido, que al madurar adquiere un color rojo intenso y se extiende hacia la glándula digestiva cerca del músculo aductor. Microscópicamente, la gónada está compuesta de numerosos folículos dentro de los que se desarrollan los gametos.

Ovocitos maduros: Los ovocitos maduros de S. limbatus (60-70 µm de diámetro) son gametos que han completado el proceso de vitelogénesis y que frecuentemente se observan en el centro del acino como si tuvieran una forma polihédrica, causada por la fijación y por la compresión de numerosos gametos acumulados en la gónada madura (Fig. 1A-B).

Fig. 1 Ovocito maduro de Spondylus limbatus. Cg: gránulos corticales; Gv: vesícula germinal; Yg: gránulos de vitelo; VL: Cubierta vitelina; Mv: Microvellosidades; FoC: células foliculares; c: citoplasma; cabeza de flecha: nucléolo. 

El núcleo (~30 µm) presenta en su interior una vesícula germinal formada de cromatina laxa y un nucléolo (~5 µm). La membrana nuclear forma numerosas lobulaciones sobre si misma, muestra abundantes poros y acúmulos de material electrondenso (Fig. 2). Al mismo tiempo, la doble membrana nuclear da lugar a sistemas de lamelas anuladas (Fig. 3), derivación relativamente frecuente en ovocitos maduros.

Fig. 2 Ovocito maduro de Spondylus limbatus. A: lobulaciones de la membrana nuclear (flechas punteadas). B: acercamiento que muestra los numerosos poros de la doble membrana nuclear (flechas sólidas). C: citoplasma; Gv: vesícula germinal, n: nucléolo, Mi: mitocondria. 

Fig. 3 Ovocito maduros de Spondylus limbatus con lamelas anuladas paralelas y cercanas a la vesícula germinal del ovocito, su aspecto es similar a la membrana nuclear de la cual probablemente derivan. al: lamelas anuladas; C: citoplasma. Gv: vesícula germinal. 

El citoplasma presenta electrodensidad intermedia debido a la abundancia de ribosomas. Sin embargo, se observan espacios o canalículos dentro el retículo endoplasmático rugoso, los cuales aparecen como un sistema o red de conexión a través de toda la célula (Figs. 4 A-C). Las vesículas del retículo endoplasmático rugoso pueden dar lugar a sistemas de lamelas anuladas (Figs. 4B-C). Entre este complejo sistema trabecular aparecen numerosas mitocondrias de morfología típica distribuidas por todo el citoplasma (Fig. 4D). Asimismo, se observan numerosas plaquetas vitelinas electrondensas y abundantes gotas lipídicas, apreciables por su menor densidad electrónica (Fig. 4C).

Fig. 4 Ovocitos maduros de Spondylus limbatus. A: Disposición en canalículos (flechas) del retículo endoplásmico rugoso en el citoplasma. B: Lamelas anuladas (flecha) en la periferia del citoplasma. C: Citoplasma con presencia de gránulos de vitelo, gotas lipídicas y lamelas anuladas. D: Agrupación de mitocondrias con la estructura típica de crestas. al: lamelas anuladas; l: gota lipídica; Mi: mitocondria; Yg: gránulos de vitelo. 

La membrana citoplásmica de los ovocitos maduros se desdobla hacia afuera para formar numerosas microvellosidades, las cuales en varios casos adquieren la forma de copa (Fig. 5A-B). Estas estructuras se encuentran embebidas en una matriz extracelular, que se extiende alrededor de todo el ovocito, llamada cubierta vitelina (~2 µm), muy evidente en esta especie, la cual es una capa ligeramente fibrosa con acúmulos electrondensos alrededor de las microvellosidades (Fig. 5B). Adyacente a la cubierta vitelina se observa la presencia de células foliculares en contacto con gametos maduros, a través de las microvellosidades (Fig. 1B).

Fig. 5 Ovocitos maduros de Spondylus limbatus. A: Microvellosidades embebidas en la cubierta vitelina. B: Acercamiento de una microvellosidad en forma de copa que muestra su origen a partir del desdoblamiento de la membrana citoplásmica. VL: Cubierta vitelina, Cg: gránulos corticales; Mv: microvellosidades. 

Ovocito maduro en reabsorción. En los gametos femeninos maduros de S. limbatus se presenta un proceso conocido como degeneración o atresia ovocitaria, el cual involucra inicialmente la vacuolación del citoplasma ocasionado por la distensión del retículo endoplásmico rugoso (Fig. 6A). El núcleo y la membrana citoplásmica presentan un deterioro en las etapas iniciales para finalmente colapsarse y dispersar las microvellosidades (Fig. 6B). Finalmente, la cubierta vitelina se desintegra y esto libera el contenido del citoplasma y del núcleo en el lumen del acino. Células hemocíticas macrófagas son observadas frecuentemente entre los restos de los ovocitos atrésicos en el acino. Estas células exhiben numerosos gránulos densos heterogéneos similares a fagosomas y varias vacuolas en el citoplasma (Fig. 6C-D).

Fig. 6 Ovocitos en degeneración de Spondylus limbatus. A: Vacuolación del citoplasma. B: Colapso del citoplasma y desprendimiento de las microvellosidades. C-D: Células hemocíticas macrófagas presentes entre los restos de ovocitos atrésicos. VL: Cubierta vitelina; Mv: microvellosidades. C: citoplasma. 

DISCUSIÓN

Las características ultraestructurales generales de los ovocitos maduros y en degeneración observadas en Spondylus limbatus han sido descritas previamente para otros bivalvos como Mytilus edulis (Pipe), Pinna nobilis (de Gaulejac et al.) y Neotrigonia margaritacea (^{Glavinic et al., 2012}). Sin embargo, existen ligeras diferencias con las especies taxonómicamente más cercanas como Pecten maximus (^{Dorange & Le Pennec, 1989}) y Patinopecten yessoensis (^{Chung et al., 2005}). Estas diferencias se refieren al tamaño de la cubierta vitelina y a la presencia de células foliculares en contacto con ovocitos maduros.

Respecto a la cubierta vitelina, esta es una especialización de la matriz extracelular característica de los ovocitos maduros, el grosor de la cubierta vitelina varía de acuerdo a la especie, en S. limbatus mide (~2 µm), mientras que en Pecten maximus la cubierta vitelina es más gruesa (5-6 µm), a pesar de que el tamaño de los ovocitos postvitelogénicos es de 60-70 µm (^{Chung et al., 2005}), similar a S. limbatus.

Por otra parte, la relación que pueden presentar las células foliculares con los gametos femeninos, difiere de acuerdo a las especies. En MytiIus edulis (Pipe) y P. maximus (Dorange & Le Pennec), los ovocitos jóvenes están completamente rodeados de "células foliculares". Estas células se desprenden de la zona apical de los gametos femeninos cuando los ovocitos desarrollan un pedúnculo. Mientras que en P. yessoensis y Crenomytilus grayana, el papel trófico de las "células foliculares" predomina cuando los ovocitos maduros están libres en el lumen folicular. En esta etapa, los ovocitos se encuentran completamente rodeados por células nutritivas, las cuales transfieren metabolitos por pinocitosis (^{Chung, 2007}); adicionalmente, participan en la digestión, a través de un sistema lisosomal, durante la reabsorción de los ovocitos residuales (Chung). En S. limbatus, los ovocitos maduros se encuentran comunicados con las células foliculares por medio de las microvellosidades a lo largo de la cubierta vitelina, posiblemente de la misma manera como sucede en especies como Sinonovacula constricta (Chung et al., 2008b), Meretrix lusoria (Chung), M. edulis (Pipe) donde las células foliculares desempeñan un papel en la formación de las microvellosidades. En S. limbatus la membrana citoplasmática presentó abundantes microvellosidades embebidas en la cubierta vitelina; a través de esta capa la célula puede ingresar al citoplasma el material extracelular necesario para la síntesis del vitelo. Esto sugiere que las microvellosidades, son especializaciones de la membrana citoplasmática destinadas a aumentar la superficie de absorción de la célula.

El citoplasma presentó abundantes plaquetas vitelinas en distinto grado de formación, las cuales pueden originarse a través de la endocitosis o bien, a partir de la síntesis y modificaciones posteriores de algunos orgánulos citoplasmáticos tal como ocurre en Cyclina sinensis (^{Chung et al., 2007}). La presencia de modificaciones de la envoltura nuclear y el patrón de organización nuclear altamente lobulado, y por consiguiente una gran superficie que asegura el intercambio núcleo-citoplasma, sugieren su incorporación de forma estructural posiblemente relacionadas con el proceso de formación del vitelo.

Por otro lado, en los ovocitos maduros de S. limbatus se observa una compleja morfología de la membrana nuclear que da lugar a lobulaciones de la doble membrana, formando sistemas de espacios membranosos que se separan del núcleo y se incorporan al citoplasma. Al mismo tiempo se observa la acumulación de material electrondenso en la superficie de la membrana nuclear externa. La aparición de acúmulos electrondensos producidos por emisiones del núcleo a través de los poros nucleares y evaginaciones de la membrana nuclear fue descrita por primera vez por ^{Anderson & Beams (1956}) en ovocitos de insectos. Posteriormente, se han encontrado estas estructuras en ovocitos de muchas especies, incluyendo a los bivalvos Mytilus edulis (^{Durfort, 1973}) y Tapes decussatus (^{Bozzo et al., 1996}). Estos acúmulos a menudo se asocian a grupos de pequeñas mitocondrias (tal como se observó para S. limbatus), por lo que se les denomina cemento mitocondrial, y se piensa que participan activamente en la formación de las plaquetas vitelinas. La gran plasticidad de la superficie del núcleo, permite que este ocupe una extensión considerable de la célula y, como es habitual en los ovocitos, da origen a agrupaciones de lamelas anuladas, las cuales en este caso pueden formarse también a partir del retículo endoplasmático rugoso.

Las lamelas anuladas son formaciones relativamente frecuentes en el citoplasma de los ovocitos maduros y su origen puede ser a partir del retículo endoplasmático rugoso, como sucede en el poliplacóforo Trachydermon cinereus (^{Durfort, 1976}), o de la membrana nuclear como se ha observado en el bivalvo M. edulis (Durfort, 1973). En los ovocitos de S. limbatus, el origen pareciera ser doble de acuerdo a las imágenes descritas. En cuanto a su función, una de las hipótesis plausibles es que se trate de una reserva de la membrana nuclear para las posteriores divisiones celulares o como un medio de incrementar el área de síntesis de proteínas (Pipe).

La atresia es el proceso por el cual los ovocitos se degeneran progresivamente y son reabsorbidos. Puede ocurrir como un proceso fisiológico natural o como resultado de condiciones naturales desfavorables (^{Jobling et al., 2002}); el proceso de degeneración ovocitaria descrito aquí para S. limbatus es un fenómeno comúnmente observado en moluscos (Pipe) una vez que ha concluido el desove. Las modificaciones celulares observadas en el presente estudio son muy similares a las reportadas previamente en bivalvos (Pipe). Las células observadas entre los restos de los ovocitos atrésicos corresponden a hemocitos macrófagos, de acuerdo a lo descrito por Dorange & Le Pennec para P. maximus. Estas células probablemente desempeñen un papel en la reabsorción de material lisado favorecido por la presencia en su interior de diferentes enzimas lisosomales capaces de digestión. Por lo tanto, es posible que los nutrientes puedan ser transferidos a los nuevos gametos por medio de la hemolinfa o del tejido conjuntivo intersticial (Dorange & Le Pennec).

Dado lo anterior, podemos decir que los ovocitos maduros de S. limbatus presentan el aspecto característico de células metabólicamente activas y altamente sintetizadoras, pero que al no ser liberados durante el desove, pueden ser reabsorbidos como resultado de un proceso fisiológico que permite aprovechar los nutrientes acumulados durante el proceso de gametogénesis. Esta descripción ultraestructural sirve como línea base para futuras comparaciones con organismos expuestos a condiciones desfavorables.