INTRODUCCIÓN

^{Quint et al. (2002}) describieron que el patrón óseo en la aleta caudal puede ser alterado por la expresión ectópica de morfógenos tales como Sonic Hedgehog (Shh) y proteína morfogenética del hueso (BMP2b).

En 2015 Rojas et al. realizaron la descripción de la aleta caudal normal del alevín de Salmón del Atlántico (S. salar). En el presente se realizó un análisis comparativo de los cambios anatómicos e histológicos de la aleta caudal del alevín post-eclosional deformada y se evaluó la expresión del morfógeno Shh durante un episodio accidental que estuvo relacionado con cambios de la temperatura.

Como hasta el momento no se ha reportado las características morfológicas de la aleta aguzada en estadios post eclosionales tan tempranos, en este estudio se presenta una deformación de la aleta caudal que afectó a los alevines con saco vitelino de Salmón del Atlántico (Salmo salar) en el Sur de Chile, durante el año 2012, caracterizada por presentación de la aleta caudal con aspecto de “cola aguzada”.

MATERIAL Y MÉTODO

Las ovas fueron obtenidas de reproductores que realizaron su ciclo de vida completa en agua dulce, las cuales se caracterizan genéticamente por presentar un locus de rasgo cuantitativo (QTL) para la resistencia a la necrosis pancreática infecciosa (IPN).

Las ovas (N=3.661.281) fueron incubadas en piscicultura primaria a temperaturas que variaron entre los 5,3 a 8° C (temperatura de río) hasta las 306 y 319 Unidades térmicas acumuladas (UTAs). Posteriormente fueron trasladadas a una piscicultura definitiva, siendo la temperatura de ingreso de 3 °C, luego se llevó a cabo, un proceso de aclimatación, que consistió en incrementar la temperatura de cultivo de forma gradual hasta llegar a los 5 °C. Repentinamente, el sistema presentó un aumento de la temperatura hasta los 10ºC. Transcurrido 5 días de iniciado el evento se redujo la temperatura a 6 °C (a razón de un grado por día). Después de 25 días se realizó una aclimatación previa al traslado a la fase de cultivo de primera alimentación, subiéndose la temperatura de cultivo gradualmente a 10 °C. Durante el cultivo la saturación de oxígeno fue de 100 % (normoxia).

Para la descripción morfológica macroscópica se realizó un análisis de 638 peces, pertenecientes a tres lotes, mantenidos en 3 unidades de cultivo diferentes, utilizando una lupa esteroscópica (Leica). Los hallazgos en la aleta caudal fueron clasificados como normales (sin hallazgos), leves a moderados (se observaba una alteración de la forma de la aleta caudal) y severo (se observaba un plegamiento de los rayos de la aleta caudal, dando la apariencia de una aleta aguzada).

Con el fin de conocer el estado sanitario de los peces, se realizó análisis de laboratorio de 60 especímenes, para determinar la condición sanitaria respecto del Virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), Virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV), Piscine orthoreovirus (PRV1,2 y 3), Flavobacterium psychrophilum y Renibacterium salmoninarum de acuerdo a las condiciones para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuencias de partidores y sondas previamente descritas (^{Blake et al., 1995}; ^{Wiklund et al., 2000}; ^{Chase et al., 2006}; ^{Snow et al., 2006}; ^{Olsen et al., 2015}; ^{Takano et al., 2016}). Adicionalmente muestras de branquias y riñón fueron inoculadas en agar tripticasa soya (^{Whitman, 2004}) y ^{Anacker & Ordal (1959}) e incubadas a 22°C y 15 °C, respectivamente para la determinación de patógenos bacterianos.

Adicionalmente se procedió a analizar otros 60 alevines que tenían entre 600 y 700 UTAs, los cuales fueron pesados y posteriormente sacrificados con Benzocaína al 5 % (BZ-20®, Veterquímica) disuelta en el agua a una dosis de 800 mg/l, (de acuerdo a normas éticas de investigación con animales), luego fueron fijados en formalina tamponada al 10 %, por 48 horas. Previo a su procesamiento se evaluaron las características morfológicas de la aleta caudal tales como longitud y ancho.

Para la descripción morfológica mesoscópica se utilizaron 30 alevines, los que fueron sometidos a digestión proteica (tripsina) y expuestos al colorante azul de Alcián, que tiñe de color azul a los glicosaminoglicanos de las Lepidotriquias (^{Rojas et al., 2015}). Los ejemplares diafanizados fueron observados y fotografiados con un microscopio Zeiss Axiostar plus que tiene polarizadores adaptados.

Para la descripción histológica se utilizaron 30 alevines los que fueron incluidos en paraplast, seccionados en cortes sagitales seriados de 5µm de espesor, posteriormente los cortes fueron procesados mediante técnicas histológicas de rutina H & E lo cual permite observar la histología general de la aleta.

Para evaluar la expresión de la proteína Sonic hedgehog (SHH), se utilizaron los mismos 30 alevines del análisis histológico, se realizó una técnica inmunohistoquímica con el anticuerpo anti Shh (Shh, H-160, Santa Cruz). Desde los alevines incluidos en paraplast, se obtuvieron cortes de 5 µm, con micrótomo Microm (HM315R) los cuales se adhirieron a portaobjetos con carga positiva (Citoglas). Se adhirieron 5 cortes por portaobjeto, considerando un total de 2 portaobjetos por alevín. La recuperación de antígenos fue realizada en vaporera por 40 minutos, con los cortes sumergidos en Antigen unmasking solution (Vector). Se realizó bloqueo de peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno en metanol y bloquéo inespecífico de proteínas con PBS+BSA al 3 %. Para la incubación con el anticuerpo primario Shh (Shh, H-160, Santa Cruz) se usó una dilución 1:100 en buffer fosfato salino (PBS). Para la detección del anticuerpo primario se incubó con polímero conjugado con anticuerpo anti conejo y peroxidasa de rábano (HRP) (Zymed) durante 15 min. Como sustrato para la HRP se usó diaminobencidina (DAB, Vector Labs). El control negativo estuvo dado por el desarrollo de la técnica inmunohistoquímica completa, pero sin considerar los anticuerpos primarios. Como control positivo interno se consideró la notocorda. Los cortes sagitales seriados de los peces fueron analizados consignando los tejidos que fueron marcados positivamente.

Análisis estadístico. A los valores obtenidos para las variables cuantitativas peso y longitud de cuerpo, largo y ancho de aleta caudal, se les realizó estadística descriptiva y fueron sometidos a prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Las diferencias observadas entre peces normales y deformes, fueron analizadas mediante prueba t de Student o U de Mann Whitney, utilizando el paquete estadístico IBM SPSS 20.0

RESULTADOS

Cuando se compararon, las tres unidades de cultivo (lote) de la piscicultura se encontraron alevines deformes en las tres, pero hubo diferencias en la frecuencia y porcentaje de los peces severamente deformados, estando mucho más afectada la línea 1 de incubación con un 18,6 % en comparación con las otras dos líneas que presentaron solo 9,8 % y 9,5 % (Tabla I).

El peso de los alevines normales fue similar al de peso de alevines deformes (p>0,05), al igual que la longitud de la aleta caudal (p>0,05) (Fig. 1) y el ancho de la aleta de los alevines deformes fue inferior (mediana 1mm) al de los alevines normales (mediana 3,5 mm) (p<0,05) (Fig. 2, Tabla II).

Todos los análisis de laboratorio realizados para evaluar el estado sanitario de los peces resultaron negativos, indicando que los peces no presentaban patógenos virales ni tampoco presentaban patógenos bacterianos.

En los alevines eclosionados (475 UTAs) no se observaron cambios morfológicos, pero a las 600 UTAs se visualizó una deformación en la aleta caudal, la cual evolucionó en frecuencia y severidad hasta los 700 UTA (Tabla I, Figs 3A, alevín normal, 3B, aleta moderadamente deformada), 3C y 3D aleta severamente deformada).

En las aletas caudales de los alevines normales, los rayos dérmicos llamados Lepidotriquias presentan gran cantidad de glicosaminoglicanos y se pueden visualizar mediante el azul de Alcián (Fig.s 4 y 5). Cada Lepidotriquia presenta segmentos cortos separados por articulaciones y en la parte más distal terminan en Actinotriquias (Fig.s 4 y 5). Las Lepidotriquias están revestidas por escleroblastos.

Después de las 600 UTAs de incubación, se evidenciaron los primeros cambios morfológicos: a) ausencia de surco entre los lóbulos dorsal y ventral b) las Actinotriquias se pliegan y adhieren entre ellas (Fig. 6), c) desorganización de las Lepidotriquias, ondulación y fractura de ellos (Figs. 3B y 7), d) se pierde la forma de abanico y adquiere la forma aguzada (Figs. 3C, 3D y 8), presentando una base de 3 mm que se reduce a 1+0.5 mm en el extremo distal. Se pierde totalmente el ordenamiento espacial de rayos e interrayos y la distancia entre ellos (Figs. 3C, 3D, 8).

En los alevines deformes también se encontraron las Lepidotriquias (revestidos por escleroblastos (son comparables a células osteógenas) de los cuáles podemos ver sus núcleos aplanados (Figs. 9 y 10). En las zonas interrayos observamos vasos sanguíneos de distinto calibre ocupando la mayor parte de ella (Figs. 9 y 10). Además soluciones de continuidad en el endotelio (ura 11) y zonas hemorrágicas (eritrocitos, linfocitos, núcleos). El morfógeno Shh resultó positivo en núcleos de células basales de la epidermis, y en escleroblastos de Lepidotriquias, como también en su control positivo que era la notocorda (Figs. 12 y 13).

DISCUSIÓN

En las tres unidades de cultivo de la piscicultura se encontró mas de un 80 % de los alevines normales y menos de un 20 % estaban deformes. El hecho de que los alevines presentaron una aleta caudal de menor ancho tomando una forma aguzada, impide la normal natación. En los peces adultos la aleta se puede regenerar completamente (^{Marí-Beffa et al., 1999}; ^{Rolland-Lagan et al., 2012}), sin embargo, en los alevines severamente deformados, esto no ocurrió, no obstante, estos mostraron señales que indicaban la presencia de centros emisores de morfógenos activos. Algunos autores como ^{Nakatani et al. (2008}) han explicado que se tiene que gatillar la migración de células mesenquimales desde el blastema para que pueda ocurrir la regeneración de la aleta caudal. En los alevines este proceso no ocurrió debido a las alteraciones encontradas en los vasos sanguíneos, del blastema como soluciones de continuidad, hemorragias y bacterias.

La formación de las Lepidotriquias se inicia por el contacto de la epidermis con el tejido mesenquimático subyacente. Según ^{Akimenko et al. (2003}) la epidermis tiene un papel fundamental en el proceso de formación de Lepidotriquias. En este estudio se pudo observar la presen- cia del morfógeno Shh en la capa basal de la epidermis y también en los escleroblastos de las Lepidotriquias y endotelio de algunos vasos sanguíneos. Esto se relaciona con los estudios de ^{Wargelius et al. (2009}) y ^{Rojas et al. (2016}) que sugieren que Shh puede ser usado como un marcador de proliferación de osteoblastos o escleroblastos. Otros autores, como ^{Laforest et al. (1998}) y Rojas et al. (2014), indican la importancia de los genes Shh en la formación de los patrones de las Lepidotriquias, existiendo una gradiente de señalización de Shh que regula la expresión diferencial de genes de una manera dependiente de la concentración. Este morfógeno siempre produce inmunomarcación en la notocorda del salmón, por lo tanto, se utiliza esta estructura como control positivo (Rojas et al., 2015).

Existen varios factores ambientales que pueden causar deformidades de la aleta caudal, incluidos los efectos producidos por altas temperaturas, la contaminación por metales pesados, los efectos de la polución (^{Jawad et al., 2018}), o los efectos producidos por luz continua en el desarrollo óseo (Wargelius et al.). Nosotros descartamos los factores sanitarios debido a que los peces resultaron negativos a patógenos virales y bacterianos. En este caso, la causa fue conocida y estaba relacionado con cambios bruscos de la temperatura del agua y aunque no fue alterado el nivel de la expresión de los morfógenos Shh desde el epitelio, hubo cambios histológicos en el blastema interrayos lo cual afectó la formación de las Lepidotriquias. Descartamos a la hipoxia como factor etiológico, porque en hipoxia aumentan los brotes angiogénicos y el número de vasos sanguíneos, lo cual en este caso no ocurre y además porque la hipoxia en alevines se relaciona con deformidad de la columna vertebral (^{Castro Sánchez et al., 2011}) y no por deformidad de aletas. Una vez establecidas las condiciones de cultivo la condición descrita disminuye significativamente hasta llegar a cero.

CONCLUSIONES

La deformación se observa desde los 600 UTAs, Lepidotriquias de la aleta caudal se desorganizan, fracturan y no se regeneran. Existe también una vasodilatación y solución de continuidad de endotelio y hemorragias en las zonas interrayos. Los centros emisores de señales para la regeneración de Lepidotriquias permanecieron activos en la epidermis pero el blastema subyacente estaba alterado en los peces que enfermaron. Este defecto se gatillaría por errores del manejo perieclosional, como cambios bruscos de la temperatura.