Rol del virus Herpes simplex en la queratitis inmune estromal Role of herpes simplex virus in the immune stromal keratitis Claudia Vinagre del P, María José Martínez G, Marlene Vogel G, Leonidas Traipe C, Juan Stoppel O, Olympia Squella G, Miguel Srur A y Raimundo Charlín E.

Background: Herpes simplex virus (HSV) infection of the cornea is a leading cause of blindness in occidental countries and a common recurrent manifestation of it is the immune stromal keratitis (ISK). However, it is not known whether active viral replication occurs during the acute phase of the disease, because isolation of the virus by conventional culture techniques has not been accomplished. Aim: To establish the presence of HSV in patients with ISK. Material and methods: Fourteen corneal swabbing samples, from active diseased eyes of patients with clinical diagnosis of ISK, were submitted to Herpchek® and PCR for the identification of HSV antigens and genome. Results: All ISK samples were negative by both techniques. Conclusions: It was not possible to identify HSV antigens nor their genome by the methodology used. It is likely that, they can’t be detected in corneal superficial layers or probably there is no viral replication at this stage of the disease, so antiviral therapy should be reconsidered. (Rev Méd Chile 2001; 129: 259-63).
(Key-words: Corneal diseases; Keratitis; Keratitis herpetic; Herpes simplex).

Recibido 8 de septiembre, 2000. Aceptado en versión corregida 26 de diciembre, 2000.
Trabajo financiado por Proyecto Fondecyt # 1950631.
Programa de Virología y Departamento de Oftalmología, Facultad de Medicina.
Universidad de Chile.

El virus Herpes simplex (HSV) es una de las principales causas de ceguera corneal en el mundo^1,2. Aunque la incidencia y prevalencia de las infecciones oculares herpéticas se desconocen, cerca de 500.000 nuevos casos se comunican anualmente en los Estados Unidos³. En Chile, estudios revelan que las infecciones oculares por HSV representan la principal causa de queratoplastia, con una frecuencia del 36%².

Desde una perspectiva tanto diagnóstica como terapéutica, la queratitis por HSV representa actualmente un desafío para el médico. Anatómicamente, el compromiso corneal primario puede localizarse a nivel del epitelio, del estroma o del endotelio, existiendo dos manifestaciones del compromiso por HSV que involucran primariamente al estroma: la queratitis necrotizante estromal (NSK) y la queratitis inmune estromal (ISK)⁴. En la NSK los hallazgos clínicos son la ulceración, necrosis e infiltración densa del estroma. La inflamación severa puede llevar a una perforación en un período corto de tiempo. La ISK es una reacción inflamatoria no-ulcerativa del estroma corneal. Puede verse como una opacidad estromal blanca y pequeña, o como un infiltrado celular blanco y denso. Algunos casos pueden tener un anillo inmune acompañante. La cronicidad de esta reacción puede llevar a la neovascularización del estroma, lo que puede ocurrir días o semanas posteriores al inicio de la inflamación. Dicha inflamación puede ser central, paracentral o periférica, sectorial o difusa^4,14.

Mientras la NSK se produciría como consecuencia directa de la replicación viral en el estroma, el mecanismo patogénico de la inflamación observada en la ISK sería consecuencia de la presencia de antígenos virales retenidos o secuestrados en el estroma, que gatillarían una respuesta antígeno-anticuerpo-complemento, que daría como resultado el daño estromal^4-6. La evidencia de que una partícula viral o antígeno de HSV puede ser encontrada a través de todos los estratos corneales de pacientes con queratitis herpética, y durante las recurrencias de las mismas, también apoya la idea de que algunas enfermedades estromales se deben a una combinación de infección viral activa y procesos inmunes asociados^4,7. Más aún, virus latentes han sido detectados en córneas de pacientes con queratitis estromal herpética en su fase inactiva⁸. La comprensión de este aspecto patogénico esclarecería la discusión con respecto a sí una combinación de antivirales y corticoesteroides son necesarios para el tratamiento de los pacientes con ISK.

La técnica de referencia para el diagnóstico de infecciones por HSV es el aislamiento viral (AV) en cultivo celular⁹. Sin embargo, diferentes estudios muestran que el AV no puede ser utilizado para confirmar el diagnóstico de una queratitis herpética cuando la expresión de ésta se encuentra únicamente a nivel del estroma corneal^9,10. Nuestro objetivo fue identificar la presencia de HSV detectando antígenos y/o genoma viral en pacientes con ISK, al momento del diagnóstico clínico, con el fin de precisar la etiología, aportar en el tratamiento específico y en el conocimiento de la evolución de los pacientes con dicha patología.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes: de un total de 188 pacientes con queratitis herpética, sin tratamiento con aciclovir a lo menos 24 h previo a la toma de muestra, se estudiaron 14 pacientes con diagnóstico clínico de ISK y sin otra patología ocular asociada, correspondientes a la totalidad de pacientes con este diagnóstico clínico. Los pacientes provenían de los Servicios de Oftalmología del Hospital Clínico de la Universidad de Chile JJ Aguirre, Hospital Barros Luco Trudeau, Hospital San Juan de Dios y Hospital Roberto del Río, incorporados entre 1995 y 1997. Como hallazgo clínico de ISK se consideró la presencia de edema disciforme, sin otra lesión concomitante.

Variables: en cada caso incorporado el oftalmólogo consignó, en una ficha confeccionada ad hoc, los siguientes datos: edad, sexo, antecedentes mórbidos relevantes, antecedentes de herpes oral y/o ocular, evolución del cuadro clínico actual en las categorías de agudo (menos de 21 días), subagudo (entre 21 días y 3 meses) o crónico (más de 3 meses), severidad de la lesión (basado en la extensión de las lesiones, tipo de tejido corneal comprometido y grado de déficit visual con la mejor corrección óptica al momento del diagnóstico), clasificándose en las categorías de leve, moderado o severo, y el diagnóstico clínico.

Muestras: las muestras de torulado corneal, tomadas por un oftalmólogo previamente entrenado, fueron obtenidas del ojo con enfermedad activa y recolectadas en 1 ml de medio de transporte viral; alícuotas de éstas fueron almacenadas a -80°C hasta el desarrollo de nuestro estudio. El AV realizado entonces fue negativo en todas las ISK clínicas10. Las 14 muestras clínicas fueron testeadas en duplicado por el Herpchek Direct Herpes Simplex Virus Antigen Test (NEA-106; DuPont Medical Products®), un ensayo inmunoenzimático comercial, según el protocolo standard del Herpchek. Cada ensayo fue validado con controles positivos y negativos. En principio, el Herpchek es un ELISA, donde el antígeno del HSV, presente en las muestras clínicas, es capturado por anticuerpos de conejo anti HSV que cubren los pocillos de poliestireno del kit. El antígeno capturado es posteriormente detectado mediante un anticuerpo monoclonal biotinilado anti-HSV específico. Los resultados son leídos en un lector espectrométrico a 490 nm.

Para la amplificación por PCR, las muestras fueron procesadas de acuerdo a un protocolo de extracción de DNA⁹. Brevemente, 100 ul de muestra se incubaron a 55°C con 100 ug/ml de proteinasa K, 0,5% SDS, 1 mM EDTA y 10 mM Tris-HCl (pH 7,8), en un volumen final de 500 ul, durante una hora. Luego de adicionar tRNA como agente catalítico, la solución se extrajo con fenol-cloroformo y el DNA precipitado con etanol. El precipitado fue disuelto en 25 ul de buffer TE (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA), utilizándose 10ul de éste para realizar la PCR. El volumen de reacción fue de 50 ul, conteniendo buffer 1 X (20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl), 1 mM MgCl, 15% glicerol, 200 uM dNTP (Gibco BRL®), 2,5 unidades de Ampli Taq DNA polimerasa (Gibco BRL®) y 50 pM de cada partidor de oligonucleótidos, los que reconocen secuencias conservadas del gen de la DNA polimerasa del HSV-1 y HSV-2¹¹. Veinte microlitros de la mezcla de reacción fueron sometidos a electroforesis en gel de Agarosa (Gibco BRL®) al 2%, teñido con bromuro de etidio. Cada ensayo incluyó un control negativo, un blanco de reactivos y HSV-1 (F), gentilmente donado por el Dr. Bernard Roizman¹², como control positivo.

RESULTADOS

El grupo de pacientes estudiados estaba integrado por ocho mujeres y seis hombres, con un promedio de edad de 27,3 años, con edades máxima y mínima de tres y 63 años. De todos ellos, cuatro presentaban una evolución crónica al momento del diagnóstico, se registraron ocho casos agudos y dos subagudos. Tres de los pacientes fueron catalogados de grados severos, dos de los cuales correspondían a pacientes cuya evolución fue crónica; 10 como moderados, dos de ellos de evolución crónica y no se obtuvo el dato en uno de ellos. En relación al antecedente de infección previa por HSV: cuatro pacientes refirieron no tener ningún antecedente, nueve pacientes dan antecedentes de infecciones oculares por HSV, (uno de ellos además había presentado infecciones de la cavidad oral por este virus) y en uno de los pacientes no se obtuvo información al respecto. Ninguno de los pacientes había recibido tratamiento con antivirales a lo menos 24 horas previo a la toma de muestra, tres de ellos no habían recibido nunca ningún tipo de tratamiento y el resto de los pacientes refirió alguna vez haber sido tratado ya sea sólo con antivirales tópicos, o estos asociados a corticoides.

La técnica utilizada para la detección de antígenos de HSV, Herpchek®, arrojó resultados negativos en las 14 muestras clínicas estudiadas, con valores de absorbancia que fluctuaron entre 0,012 y 0,095. El valor de corte calculado fue de 0,144 y el control de reactivos fue de 0,129. Los controles positivo y negativo proporcionados por el kit entregaron valores de absorbancia de 1,976 y 0,065, respectivamente.

La reacción de amplificación mediante PCR, realizada a las 14 muestras de queratitis inmune estromal que fueron previamente sometidas a extracción de DNA, también resultaron negativas. El control positivo amplificó la banda de 211 pares de bases, tamaño esperado del fragmento de HSV a amplificar, y el control negativo y blanco de reactivos fueron negativos.

DISCUSIÓN

Dado que el número de pacientes con ISK es bajo, nuestros resultados no nos permiten sacar conclusiones estadísticas en relación a las características clínicas del grupo estudiado. Aun cuando se describe que la ISK es una patología de curso clínico crónico¹⁴, la mayor parte de los pacientes de nuestro estudio se encontraba en evolución aguda al momento del diagnóstico. Esta patología se caracteriza por períodos de inflamación recurrentes, donde los pacientes pueden experimentar períodos constantes de inflamación de bajo grado, con pequeñas fluctuaciones en la severidad de ella, o bien pueden presentar períodos de completa resolución de la inflamación con episodios intermitentes de inflamación severa¹⁴. Ambas evoluciones pueden explicar la detección de un curso agudo en nuestro estudio, ya que la mayoría de los pacientes refiere episodios clínicos similares previos al actual, apoyando así la cronicidad.

Los resultados del presente trabajo revelan que no fue posible detectar antígenos de HSV a partir de muestras de torulado corneal de pacientes con ISK en la fase activa de la enfermedad, indicando una ausencia de replicación viral y expresión de antígenos virales al momento de la toma de muestra, esto es, cuando la ISK es clínicamente detectable. Estos datos apoyan la idea de que probablemente estamos enfrentados a una reacción de hipersensibilidad retardada a antígenos de HSV que se encuentran fijos o secuestrados en el estroma corneal⁵. Estudios previos indican que virus replicativo, así como mRNA, se encontrarían ausentes en la córnea en el momento en que las lesiones se hacen clínicamente aparentes, pero que un período inicial de replicación viral es necesario para poder inducir la queratitis estromal por HSV^6,7. Sin embargo, se debe tener en cuenta el hecho de que el tejido dañado en esta patología yace en las capas corneales profundas, lo que hace muy difícil obtener una muestra representativa de la lesión mediante el torulado corneal superficial.

Trabajos anteriores difieren de nuestros resultados, ya que revelan PCR positivas para HSV en pacientes con queratitis estromal^9,13. Se debe considerar que en el trabajo de Yamamoto et al, no existe una descripción del tipo de daño corneal observado en los pacientes, el que pudiese corresponder a un compromiso de tipo necrotizante, donde es factible detectar DNA de HSV mediante PCR a partir de muestras de torulado corneal¹⁰. Por otra parte, es posible también que un daño epitelial concomitante no hubiese sido detectado^5,14. En conjunto, nuestras observaciones apuntan a la hipótesis de que la respuesta inflamatoria crónica que tipifica a la queratitis estromal por HSV ocurriría en un tiempo y/o lugar donde los antígenos y genoma virales no pueden ser demostrados mediante las metodologías utilizadas. Esto pudiese indicar que las células T presentes en la córnea pudiesen ser activadas para orquestar el evento inflamatorio, no mediante una interacción con péptidos virales, pero quizás en respuesta a determinantes del propio huésped que se ven desenmascarados como resultado de una infección previa por HSV^6,15,16.

El manejo de la infección ocular por HSV sigue siendo un desafío para los oftalmólogos, a pesar de los recientes avances realizados en el desarrollo de drogas antivirales. Idoxuridina, vidarabina, trifluoridina y aciclovir, han sido efectivas en el tratamiento de la queratitis epitelial¹⁷. Sin embargo, la enfermedad estromal ha mostrado ser menos accequible a la terapia antiviral¹⁷. Aunque es aceptado que la ISK tiene una base principalmente inmunológica¹⁸, los pacientes son tratados con corticoesteroides en asociación con antivirales, debido a ensayos clínicos que han demostrado que la terapia antiviral puede reducir la ocurrencia de una queratitis epitelial durante el tratamiento con antiinflamatorios esteroidales^17,19,20. Sin embargo, su uso en el tratamiento de la ISK, además de como profiláctico, ha sido desalentador. Se debe considerar que existe menor riesgo de recurrencia de una queratitis epitelial al utilizar preparaciones mas diluidas de corticoesteroides¹⁹, y que esta patología puede recurrir aun utilizando terapia antiviral concomitante¹⁹. Considerando la posibilidad de la emergencia de resistencia a las drogas antivirales, su uso en asociación con antiinflamatorios esteroidales debiera ser cuidadosamente evaluado.

Diferentes estrategias y metodologías deberán ser utilizadas en el estudio de la ISK, para establecer el rol que desempeñaría HSV en la patogenia de esta patología.

Correspondencia a: Dra. Claudia Vinagre del Prado. Programa de Virología, ICBM, Facultad de Medicina, Independencia 1027, Santiago, Chile. E-mail: mmartine@machi.med.uchile.cl Fono: 6786322. Fax: 6786124.

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