Valores de referencia para proteína transportadora de hormona de crecimiento en una población pediátrica normal Normative values of growth hormone binding protein (GHBP) for a Chilean pediatric population Teresa E Salazar C1, M Verónica Méricq, Marcela Espinoza F, Germán Iñiguez V2, Pilar Carvallo de SQ3, Fernando Cassorla G

Circulating concentrations of the high affinity growth hormone binding protein (GHBP) may be a marker of GH receptor density as well as GH sensiffvity. Goal: To determine values of GHBP for a normal Chilean pediatric population. Methods: We determined GHBP levels in 73 males and 73 females between 4 to 15.5 years and 4 to 16.8 years respectively, divided in 7 groups according to age and puberal status. Results: The population was normally distributed in weight, height and body mass index (BMI). GHBP activity increased up to Tanner IV in males and Tanner III in females, and decreased slightly thereafter in Tanner V and IV respectively. There was a significant difference between GHBP levels of preschool children and those found in Tanner II to V in both sexes (p<0.05). In adition, we found a positive correlation between GHBP vs weight, height and BMI (p<0.001) in males and females. Conclusion: The availability of this methodology allows us to establish the normative value of GHBP in our population and provides useful information to interpret GH circulating levels in children with growth disorders.(Rev Méd Chile 2001; 129: 382-9)
(Key-Words: Growth; Pediatrics; Somatotropin; Somatropin)

Recibido el 29 marzo, 2000. Aceptado en versión corregida el 27 febrero, 2001.
Trabajo financiado parcialmente por Proyecto Fondecyt #1970276
Instituto de Investigaciones Materno Infantil (IDIMI), Facultad de Medicina, Universidad
de Chile. Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias
Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile.
¹Tecnólogo Médico, Master en Cs. ²Químico Farmacéutico. ³Doctor en Biología

La hormona de crecimiento (GH) desempeña un papel esencial en la modulación del crecimiento lineal, como también en el control de procesos metabólicos durante todas las etapas de la vida^1-3. El efecto intracelular de la GH se ejerce a través de la unión de ésta a su receptor (GHR) ubicado en la membrana plasmática de las células blanco⁴. El gen del receptor de GH humano reside en el cromosoma 5 y consiste de 9 exones codificantes. El exón 2 codifica al péptido señal, los exones 3 a 7 al dominio extracelular que corresponde a aproximadamente 246 aminoácidos, el exón 8 al dominio transmembrana de 24 aminoácidos y el exón 9 y parte del exón 10 al dominio intracelular de 350 aminoácidos^2,5. Existe una forma soluble de este receptor de membrana, la proteína transportadora de GH (GHBP) de alta afinidad que corresponde al dominio extracelular del GHR^6,7. Esta proteína se obtiene por ruptura proteolítica del receptor en humanos y conejos⁸ y se piensa que sus niveles pueden indicar indirectamente la actividad y densidad del GHR⁹ celular, así como la sensibilidad a GH¹⁰. Esta forma soluble del receptor nos brinda la oportunidad de medir una proteína circulante que puede entregar información acerca del receptor tisular.

La GHBP de alta afinidad humana es una glicoproteína de 61 kDa⁷ que se une a la GH de 22 K con una alta afinidad (K_a= 3-9x10⁸ M^-1) y una capacidad de unión limitada (20 ng/ml)^6,11. Su concentración promedio en el plasma de un adulto es de alrededor de 1 nM y une a cerca del 40-45% de la GH 22 K circulante bajo condiciones basales¹², con una vida media del complejo GH-GHBP de alrededor de 2 días¹³. Esta GHBP inhibe la unión de la GH a los receptores como también su bioactividad in vitro¹, mientras que in vivo puede incluso aumentarla^14,15.

La actividad de GHBP en suero varía con la edad siendo sus niveles circulantes muy bajos en la vida fetal, aumentando progresivamente durante la niñez y adolescencia, alcanzando niveles constantes en el adulto³. Existe una gran variación en los niveles de GHBP entre los individuos, pero se mantienen relativamente constantes intraindividuos¹⁰, teniendo las mujeres niveles ligeramente más altos que los varones, en la etapa prepuberal. También se ha descrito una relación directa entre los niveles de GHBP e índice de masa corporal (IMC)^16,17. Los niveles de esta proteína se encuentran alterados en ciertas patologías. En las mutaciones del receptor de GH que producen un Síndrome de Insensibilidad total o parcial a GH, puede estar ausente o en niveles plasmáticos muy bajos. También se ha podido observar en niños con talla baja idiopática que en aproximadamente el 90% de ellos, los niveles de GHBP se ubican bajo el promedio para su sexo y edad y en 20% de éstos se encuentran 2 SD bajo la media¹⁸.

Considerando estos antecedentes, creemos necesario establecer la metodología para poder medir los niveles circulantes de esta proteína transportadora, por sí misma, como también, como un posible reflejo del estado del receptor. Es importante que el médico clínico tenga disponible este parámetro para evaluar de mejor manera los desórdenes del crecimiento durante la niñez.

El objetivo del presente estudio fue establecer los valores de referencia para GHBP de alta afinidad en una población chilena sana diferenciada por sexo y edad. Además estudiamos la correlación entre este parámetro y el índice de masa corporal.

MATERIAL Y MÉTODO

Sujetos. Se seleccionaron 73 varones y 73 mujeres normales procedentes de una escuela de la zona central de Santiago que no padecían de ninguna patología, de entre 4 a 15 años 6 meses y 4 a 16 años 10 meses de edad respectivamente, previa firma de los padres de un consentimiento informado. Ellos fueron divididos en 7 grupos de acuerdo a la edad y estado puberal según estadíos Tanner, la distribución de los varones se encuentra en la Tabla 1 y de las mujeres en la Tabla 2.

Mediciones. A todos ellos se les realizó una medición de estatura (en estadiómetro) (m), peso (Kg) y examen físico completo por un médico pediatra y/o endocrinólogo infantil. Se calculó el índice de masa corporal (IMC) (Kg/m²), la relación peso/talla (% P/T= peso del paciente/peso promedio de la población del mismo sexo para la estatura del paciente analizado) y talla/edad en desviaciones estándar de la media (talla/edad en desviaciones estándar = estatura del paciente - estatura promedio de la población para la edad y sexo del paciente/valor de 1 desviación estándar de la estatura para la edad y sexo del paciente)¹⁹.

Posteriormente se les tomó una muestra de sangre para determinar los niveles plasmáticos de GHBP.

El protocolo de trabajo y el consentimiento informado para los padres fue aprobado por el Comité de ética del hospital San Borja-Arriarán.

GHBP sérica. Los niveles de GHBP fueron determinados por un inmunoensayo incubando suero del paciente con GH humana marcada con ¹²⁵I y el anticuerpo monoclonal Mab 263 en presencia y ausencia de hGH no marcada (Stene y cols. Clinical availability of a rapid monoclonal-based assay for the high affinity GH binding protein (Abstract). Proc of the 74^th Annual Meeting of The Endocrine Soc 1992, 474). La forma soluble del receptor de GH (GHBP) se une a su anticuerpo (Mab 263) y a la hGH marcada para formar el complejo trimolecular anti-GHRàGHBP๲⁵I-hGH. La separación de la forma unida de la forma libre de la ¹²⁵I-hGH se realizó utilizando un 2º anticuerpo (Antimouse IgG, molécula completa, CALBIOCHEM 401210) y polietilénglicol (PEG). En breve, por muestra: 1.- tubo de actividad total (50 ul de la mezcla ¹²⁵I-GH, Mab 263: ¹²⁵I-hGH 60.000-80.000 cpm/50 ul de mezcla con una concentración de Mab 263 de 100 ug/ml, preparado en tampón PBS-EDTA con 1% de BSA y 1% de suero de ratón); 2.- tubo de unión total (25 ul de muestra problema o pool de suero de adulto normal, 50 ul de PBS-EDTA con 1% de BSA, y 50 ul de la mezcla ¹²⁵I-GH, Mab 263) y 3.- tubo de unión inespecífica (25 ul de muestra problema o pool de suero de adulto normal, 50 ul de hGH no marcada en PBS-EDTA con 1% de BSA (1 ug de GH/50 ul) y 50 ul de la mezcla 125I-GH, Mab 263). Incubar 12-14 h a 4º C. Agregar a todos los tubos, menos a los de actividad total, 300 ul de 2º anticuerpo (289,5 ul PBS-EDTA con BSA 5%, 10.5 ul antimouse IgG molécula completa). Incubar 1 h a 4º C. Centrifugar 50 min a 2.800 rpm/min. Retirar sobrenadante. Contar precipitado 1 min en contador gamma. La unión específica de la muestra problema dividida por la unión específica del pool de suero adulto normal, multiplicado por 100, expresa el resultado en % RSB (Relative Serum Binding: % de unión relativa a un pool de suero adulto normal de referencia) La marcación de la hGH con ¹²⁵I se realizó por el método de la Lactoperoxidasa²⁰. Los coeficientes de variación intra e inter ensayo fueron 5,1 y 11,3% respectivamente.

Análisis estadístico: Los resultados entregados se informan como promedio ± error estándar de la media ( ± EEM). Las correlaciones entre GHBP (%RSB) y peso (Kg), talla (m), índice de masa corporal (IMC) (peso/talla²) y relación peso/talla (% P/T) fueron determinadas por análisis de regresión lineal. La significancia fue establecida con un p<0,05.

RESULTADOS

Los datos antropométricos (peso, talla, IMC y relación P/T) de los individuos participantes se muestran en la Tabla 1 para varones y en la Tabla 2 para mujeres, expresados como00 1.± EEM. La talla se expresa en m y en desviación estándar de la media19. De estos resultados podemos observar que la población estudiada se distribuye en un rango normal de peso, talla, relación P/T e IMC.

En la Figura 1 podemos observar el patrón de distribución de los niveles de GHBP en varones y mujeres según edad y estado de Tanner. En el hombre, la actividad de GHBP aumenta progresivamente hasta el estado Tanner IV para observar una ligera disminución en el estado Tanner V. Existe una diferencia significativa entre los valores de GHBP de los 4-5 años y los encontrados en los estados Tanner II, III, IV y V (p<0,05). No existe diferencia significativa entre los estados Tanner IV y V.

Figura 1. Concentraciones séricas de GHBP en varones y mujeres. Los valores se expresan como promedio±EEM. * p< 0,05 al comparar respecto al grupo de 4-5 años.

En las mujeres (Figura 1), podemos observar que la actividad de GHBP aumenta progresivamente con un máximo en el estado Tanner III, evidenciándose una disminución de la actividad en el estado Tanner IV para empezar a aumentar levemente hacia el estado Tanner V. Existe una diferencia significativa entre los valores de GHBP de los 4-5 años y los encontrados en los estados Tanner II, III, IV y V (p<0,05). También es significativa la diferencia observada entre los estados Tanner III y IV (p<0,05).

Los niveles de GHBP son ligeramente más altos en las mujeres que en los varones, sin embargo esta diferencia no fue significativa.

En la Tabla 3A se encuentran los valores de correlación (r) entre GHBP y algunos parámetros con sus respectivas significancias en varones y en mujeres respectivamente. Podemos observar que existe una correlación positiva entre GHBP vs peso (p<0,001); GHBP vs talla (p<0,001); GHBP vs IMC (p<0,001), tanto en hombres como en mujeres, considerando cada grupo. No existe correlación entre GHBP y la relación P/T, en ambos sexos. En la Tabla 3B se encuentran las respectivas ecuaciones de la recta de las correlaciones correspondientes con significancia estadística.

DISCUSIÓN

En el presente estudio se entregan los valores de referencia de GHBP determinados en una población de niños chilenos normales, separados de acuerdo al sexo y edad desde los 4 hasta los 16 años de edad, lo que no había sido informado previamente en nuestro medio.

En concordancia con estudios previos^3-21, en nuestro grupo observamos una relación de los valores de GHBP con la edad, aumentando progresivamente con ésta tanto en varones como en mujeres. Los niveles de GHBP correlacionan inversamente con los niveles de GH^15,16. Se cree que la GHBP sérica refleja la cantidad de receptor de GH, el cual a su vez es regulado por el nivel de GH²².

Los niveles de GH aumentan durante el desarrollo puberal en ambos sexos, con niveles más altos en la pubertad media. La secreción de GH aumenta durante el inicio de la pubertad tanto en hombres como en mujeres, con un aumento significativo aún antes de los primeros signos clínicos de pubertad²³, especialmente en niñas. El mecanismo probable de incremento de la GH durante la pubertad parece ser el aumento de los esteroides sexuales, específicamente los estrógenos, en este período del desarrollo. Además, se ha observado un aumento de los niveles de GH en niños con talla baja puberales comparados con los niveles prepuberales²⁴, en pacientes tratados con esteroides sexuales exógenos^25-27 y en niños con pubertad precoz²⁸. Por otro lado, niños sanos con niveles de GHBP más bajos tienden a tener niveles de GH mayores16 y en niños con talla baja idiopática, los niveles de secreción promedio de GH de 12 h es mayor en aquellos con GHBP baja comparados con los que tienen GHBP normal²⁹.

Lo anterior nos permitiría explicar la variación de los niveles de GHBP con la edad y estadío puberal encontrados en nuestro grupo, en el que se observa un aumento de la GHBP con la edad y desarrollo puberal inicial, y una disminución de los niveles de esta proteína transportadora en el estadío puberal V en varones y en el estadío puberal IV en mujeres (Figura 1). Este efecto de la disminución de los niveles de GHBP durante la pubertad tardía fue previamente descrito por Argente y cols. en el año 1993³⁰. Esta disminución de los niveles de GHBP en la última etapa del desarrollo puberal puede también ser explicado por un efecto directo de los estrógenos y andrógenos en la expresión del receptor de GH, lo que ha sido documentado tanto in vitro³¹ como en humanos³².

Se ha descrito previamente una correlación positiva entre GHBP e IMC^16,17, la cual también se observa en nuestra población (p<0,001). En un estudio reciente realizado en adultos normales y deficientes de GH (GHD), se demuestra que aproximadamente la mitad de la variabilidad de la GHBP plasmática podría ser explicada por variación de la masa de tejido graso visceral³³. Esto podría explicar los niveles ligeramente superiores que nosotros encontramos en las mujeres, en relación con los varones. De esta misma forma, los niños con obesidad generalmente tienen velocidades de crecimiento normal, a pesar de su concentración de GH disminuída, pero habitualmente exhiben niveles séricos de GHBP aumentados^34,35. Contrariamente, los niños con retraso constitucional del crecimiento muestran niveles bajos de GHBP¹⁸ y en niños deficientes de GH, los cuales en general presentan un mayor índice de grasa corporal, se ha podido observar que la respuesta al tratamiento con GH se correlaciona con la concentración de GHBP antes de la iniciación del tratamiento. En estos pacientes el IMC no se correlaciona con la velocidad de crecimiento ni los niveles séricos de IGF-I, hasta los 12 meses de tratamiento con hGH, cuando la correlación con dichos parámetros pasa a ser significativa³⁴.

Basado en estos antecedentes, se ha especulado que la concentración de receptor de GH/GHBP puede ser un importante elemento en la mediación de la velocidad de crecimiento y desarrollo del potencial de talla genética. El IMC y los niveles de GHBP serían co-variantes, lo cual estaría siendo respaldado por la correlación significativa entre IMC y GHBP (p<0,001) que nosotros encontramos en nuestros niños. La correlación de GHBP también se ha establecido con insulina y con leptina³⁶. Sin embargo, la correlación con el IMC no existe en presencia de insulinopenia, como se observa en niños diabéticos tipo I mal controlados³⁷. Por esta razón, se sugiere que la correlación con el IMC no sería directa, sino a través de insulina, al menos en este tipo de pacientes.

Además encontramos una correlación directa y significativa de los niveles de GHBP con la talla (p<0,001), lo cual difiere de lo encontrado con otros autores^10,38. Una posible explicación podría ser el amplio rango de edad utilizado por nosotros, ya que en los trabajos mencionados los niños fueron prepúberes¹⁰ o púberes³⁸.

En conclusión, creemos que esta técnica, al permitirnos establecer los valores de referencia de la proteína transportadora de GH en nuestro medio, proporciona información muy útil para la interpretación de los niveles circulantes de GH. Esto permite una mejor evaluación de la consulta frecuente en pediatría y en endocrinología infantil, como es el niño que crece en forma anormal.

Correpondencia a: Teresa E. Salazar C : IDIMI, Hospital San Borja-Arriarán, Santa Rosa 1234, 2º Piso, Santiago. Fax: 5566890; E-mail: uniendo@canela.med.uchile.cl

Agradecimientos:

Al Dr. Jesús Argente, Dpto. de Pediatría, Hospital Niño Jesús, Madrid, España, por ayudar a desarrollar la técnica que nos permitió medir los niveles de GHBP.

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