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La litiasis biliar es considerada una patología metabólica multifactorial, siendo la dieta un factor importante en el desarrollo de esta patología. Al respecto, existen antecedentes que sugieren que una dieta alta en grasas es un probable factor predisponente para el desarrollo de litiasis biliar. Sin embargo, aun no se ha dilucidado el impacto que ejercen dietas altas en grasas en los lípidos biliares, debido a diferencias en el metabolismo lipídico inherentes al huésped, en el momento de la intervención dietética. Se han realizado estudios metabólicos en sujetos con perfil lipídico en el rango normal e hiperlipidémicos, con y sin cálculos vesiculares, pero sin lograr obtener un patrón consistente1,2. Inicialmente se postuló, que la adición de grasas en dietas destinadas a reducir el peso corporal, podrían disminuir la incidencia de colelitiasis, al potenciar la contractibilidad de la vesícula biliar3. Sin embargo, se han reportado resultados contradictorios, indicando que la elevada contractibilidad vesicular por alta ingesta de grasas, no es suficiente explicación para la colelitiasis generada por una rápida reducción de peso4. Se ha logrado establecer, que una dieta excesiva en colesterol, es un factor predisponente a hiperlipidemia, y puede inducir una sobresaturación de la bilis y formación de cálculos vesiculares. Sin embargo, el tipo de dieta grasa, y específicamente ciertos ácidos grasos, pueden también influenciar la colelitiasis5-8. Ensayos realizados en un modelo animal de conejos con hipercolesterolemia, señalan que la ingesta de una dieta alta en ácidos grasos monoinsaturados, logran normalizar los porcentajes de lípidos biliares, reduciendo el índice litogénico; por el contrario, una dieta alta en ácidos grasos ω-3-poliinsaturados incrementaron el índice litogénico9. En hámsteres se ha informado, que la incorporación de ácidos grasos saturados a la dieta incrementan los efectos litogénicos10,11. En consecuencia, los antecedentes bibliográficos parecen indicar que el grado de saturación de ácidos grasos dietéticos afecta el metabolismo de diferentes lípidos biliares, alterando su secreción y contenido biliar, pero aun no existe certeza cómo y cuándo ocurren estos cambios.
La primera etapa en el proceso de formación de cálculos vesiculares de colesterol, es la presencia de una bilis sobresaturada con colesterol, seguida de la formación de cristales de colesterol, los cuales posteriormente se agregan y crecen para constituir finalmente el cálculo macroscópico. El proceso de cristalización se genera cuando se excede la capacidad de los transportadores micelares de solubilizar el colesterol biliar, formándose transportadores vesiculares, que son termodinámicamente inestables, derivando en la producción de cristales de colesterol12-14.
Con el fin de definir la influencia de lípidos dietéticos sobre la predisposición al desarrollo de colelitiasis, estudiamos el efecto de una dieta alta en grasas en la composición lipídica de los transportadores vesiculares y micelares de colesterol biliar en ratones BALB/c.
Material y Método
Diseño metodológico
El diseño utilizado en este estudio fue de tipo cuantitativo experimental prospectivo.
Animales
Como modelo experimental se utilizaron 30 ratones albinos machos de cepa BALB/c, por su fácil manejo, presentar un genoma muy similar al de los humanos, y principalmente por poseer vesícula biliar15. Los animales fueron adquiridos del Instituto de Salud Pública (ISP), de 5 semanas de edad, con un peso promedio de 20 g. Se distribuyeron aleatoriamente en jaulas metabólicas (5 ratones/jaula), en 2 grupos: un grupo control (n = 15), y otro tratado con dieta rica en grasas (n = 15). Los animales fueron mantenidos en el bioterio de nuestra Facultad, con control de la temperatura a 20 °C y ciclos de 12 h luz/oscuridad. Recibieron agua y alimentos de una composición definida ad libitum, con monitoreo de los pesos corporales e ingesta de alimento, al menos, 2 veces por semana. Luego de 8 semanas los ratones de ambos grupos fueron sacrificados, previo ayuno de 12 h, obteniéndose muestras sanguíneas y biliares. Los animales fueron mantenidos conforme a normas internacionales dadas por la “Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio”, publicada por el National Institute of Health16.
Dieta
Se utilizó como alimento base (grupo control) un pellet comercial marca Champion®, compuesto por 20,0% de proteína, 9,2% de grasa, 54,6% de hidratos de carbono, y 6,2% de fibra (Tabla 1). Los ingredientes que componen este pellet son: maíz, harina de trigo, harina de soya, afrechillo de trigo, harina de pescado, harina de carne, harina de alfalfa, vitaminas y minerales (vitaminas A, C, D, E, K, B1, B6, B12, niacina, ácido pantoténico, biotina, ácido fólico, fosfato bicálcico, carbonato de calcio, manganeso, cobalto, cobre, zinc, yodo, hierro, magnesio, potasio). A la dieta alta en grasa, por 100 g de alimento base, se adicionó: 91 g de manteca de cerdo (marca Palmin®) y 117 g de mantequilla (marca Calo®) (Tabla 1).
Tabla 1 Composición de dietas experimentales
| Contenido | Dieta control (g/100 g) | Dieta alta en grasa (g/100 g) | |
|---|---|---|---|
| Energía (kcal/100 g) | 387 | 674 | |
| Proteínas | 20,0 | 6,8 | |
| Hidratos de carbono disponibles | 54,6 | 18,1 | |
| Grasa total: | 9,2 | 63,7 | |
| Grasa saturada | 1,0 | 34,1 | |
| Grasa monoinsaturada | 2,9 | 21,5 | |
| Grasa poliinsaturada | 5,3 | 6,6 | |
| Colesterol | 0 | 0,125 | |
| Sodio | 0 | 0,005 | |
| Fibra | 6,2 | 2,0 | |
Análisis de lípidos plasmáticos
Los lípidos plasmáticos (colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol, triglicéridos) fueron cuantificados mediante métodos enzimáticos, utilizando reactivos Labtest17.
Separación de transportadores de colesterol biliar: vesículas y micelas
Debido al reducido volumen de bilis en ratones (aprox. 100 µl/ratón), realizamos las determinaciones en una mezcla de bilis proveniente de 5 ratones idénticamente tratados. Para ello los transportadores vesiculares fueron separados de los transportadores micelares mediante cromatografía de filtración en gel18. Las bilis nativas fueron centrifugadas a 11.200 g x 10 min, y del sobrenadante se aplicaron 20 µl sobre una columna (30 x 1,5 cm) conteniendo Bio-Gel A-5m (rango operación: 10 a 5.000 kDa). Las fracciones cromatográficas (0,3 ml/fracción; flujo: 0,5 ml/min) se obtuvieron luego de eluir con buffer Tris-HCl 20 mM (pH: 8,0), NaCl 140 mM, azida sódica 3 mM, conteniendo colato de sodio 5 mM para prevenir la disrupción de los transportadores micelares.
Análisis de lípidos biliares
El colesterol en las bilis, y en las fracciones cromatográficas, se cuantificó utilizando un método químico19 y un método enzimático17, respectivamente. Los fosfolípidos en bilis y fracciones cromatográficas fueron determinados mediante el análisis de fósforo inorgánico20.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como valores promedio ± DS. Se utilizó el test t-Student, para variables independientes con distribución normal, para establecer los niveles de significancia estadística entre los distintos grupos analizados. Valores de p menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos (GraphPad software 2017).
Resultados
Al cabo de 8 semanas de consumir una dieta alta en grasas, los ratones registraron una significativa disminución en el peso corporal de 15% comparados con los controles (Figura 1), sin cambio evidente en la ingesta diaria de alimento (controles: 3,3 ± 1,8 g vs tratados: 4,3 ± 2,4 g).
Figura 1 Pesos de ratones controles (n =15) y ratones tratados (n = 15) con dieta alta en grasas durante el período experimental. (promedio ± DS) *p < 0,001; **p < 0,0001.
Los lípidos plasmáticos mostraron diferente comportamiento luego de 2 meses de ingesta de una dieta rica en grasas (Figura 2). Se observó un significativo incremento de 87% en los niveles plasmáticos de colesterol total en los ratones que consumieron dieta alta en grasas, debido a un aumento de 140% en las concentraciones de LDL-colesterol, y a un aumento de 97% en los niveles de HDL-colesterol. Sin embargo, en los animales tratados no se visualizaron diferencias significativas en las concentraciones de triglicéridos. Tampoco se observaron diferencias significativas en los niveles de glicemia (controles: 87 ± 34 mg/dL vs tratados: 79 ± 36 mg/dL).
Figura 2 Concentraciones de lípidos en plasma de ratones controles y ratones tratados con dieta alta en grasas durante 60 días (promedio ± DS). *p < 0,0001; **p < 0,05; ***p < 0,05. Abreviaturas: Col. Total: colesterol total. LDL-col.: LDL-colesterol. HDL-col.: HDL-colesterol. TAG: triglicéridos.
Los lípidos biliares del grupo tratado mostraron un significativo incremento de 13% en las concentraciones de colesterol, sin alteración en las concentraciones de fosfolípidos (Tabla 2). Además, el grupo tratado presentó un significativo aumento en las concentraciones de colesterol y fosfolípidos en los transportadores vesiculares, sin variaciones significativas en las concentraciones de fosfolípidos en transportadores micelares (Tabla 2). Más aun, se duplicó la razón colesterol/fosfolípidos de los transportadores vesiculares en los animales tratados con una dieta alta en grasas (Tabla 3).
Tabla 2 Concentraciones de lípidos biliares y lípidos en transportadores vesiculares (TV) y transportadores micelares (TM) presentes en bilis de ratones controles y ratones tratados con una dieta alta en grasas durante 60 días (promedio ± DS)
| Ratones | Colesterol biliar (mM) | Fosfolípidos biliares (mM) | Colesterol en TV (mM) | Fosfolípidos en TV (mM) | Colesterol en TM (mM) | Fosfolípidos en TM (mM) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Controles | 4,0 ± 0,5 | 39 ± 12,0 | 0,4 | 4,2 ± 2,0 | 3,7 | 29,1 ± 2,0 |
| Tratados con dieta alta en grasas | 4,5 ± 0,4* | 44 ± 15 | 1,4 | 7,2 ± 2,8** | 2,2 | 28,2 ± 2,8 |
*p < 0,05;
**p < 0,005.
Tabla 3 Porcentaje de colesterol y razón colesterol/fosfolípidos (Col/Fos) en transportadores vesiculares y micelares presentes en bilis de ratones controles y tratados con una dieta alta en grasas durante 60 días
| Ratones | Transportadores vesiculares* | Transportadores micelares* | ||
|---|---|---|---|---|
| % Colesterol | Razón Col/Fos | % Colesterol | Razón Col/Fos | |
| Control | 10,5 | 0,10 | 89,5 | 0,13 |
| Tratados con dieta alta en grasas | 38,8 | 0,20 | 59,7 | 0,08 |
*Valores corresponden a recopilación de bilis de 5 ratones.
Discusión
Nuestros resultados indican que una dieta rica en grasas puede jugar un importante rol en los primeros estadios de la colelitiasis.
En este estudio, un grupo de ratones fue sometido a la ingesta de una dieta alta en grasas (64%, conteniendo 54% de grasas saturadas, 34% de grasas monoinsaturadas y 10% de grasas poliinsaturadas), y baja en colesterol (0,14%; 0,18 mg/kcal), por un lapso de 2 meses. Durante este período, los animales tratados mostraron una significativa reducción en el peso corporal comparados con el grupo control, sin constatar diferencias significativas en la ingesta diaria entre ambos grupos. A pesar que estudios epidemiológicos han reportado una asociación positiva entre ingesta de grasas y obesidad21, recientes ensayos clínicos prospectivos, aleatorios realizados en individuos, sugieren lo contrario22. Estos últimos estudios han mostrado una pérdida mayor de peso corporal en sujetos que consumieron dietas altas en grasas (conteniendo 40% a 68% en grasas), en comparación con una ingesta de dietas bajas en grasas (conteniendo ≤ 30% en grasas), por un período de 6 meses23-28. Recientemente, una revisión de varios artículos, que compararon el peso corporal en individuos que consumieron dietas altas y bajas en grasas a largo plazo (1 a 6 años), no mostró diferencias significativas, pero al incluir sólo dietas hipocalóricas se observó una mayor disminución en el peso corporal de los grupos con dietas altas en grasas29.
El efecto de una dieta rica en grasas sobre los niveles de lipoproteínas varía considerablemente, conforme al tipo de grasa consumida. En general, se ha informado que los ácidos grasos saturados incrementan tanto el colesterol plasmático total como el LDL-colesterol29,30. En contraste, los ácidos grasos poliinsaturados, y en menor grado los monoinsaturados, disminuyen el colesterol total y LDL-colesterol31. Nuestros estudios concuerdan con estos resultados, al presentar un aumento significativo tanto en el colesterol plasmático total como LDL-colesterol, en los animales que consumieron dietas altas en grasas saturadas. Se ha sugerido, que el incremento en el colesterol plasmático en los individuos sometidos a alta ingesta de grasas, ocurre principalmente en aquellos que presentan resistencia a la insulina, ya que presentan menor absorción intestinal de colesterol32. Por otro lado, se ha reportado que los niveles de HDL-colesterol se ven incrementados en dietas a largo plazo altas en grasas saturadas o insaturadas, mientras que dietas bajas en grasas, decrecen significativamente los niveles de HDL-colesterol29. Este efecto se ratifica en nuestro estudio, que muestra un significativo aumento del HDL-colesterol de un 97% en el grupo tratado. Ello se podría explicar porque, en respuesta a una dieta alta en grasas, se genera una probable disminución en la captación hepática de HDL por una regulación negativa del receptor de HDL (Scavenger Receptor B1 -SRB1), dificultando el transporte reverso de colesterol33. Adicionalmente, dietas bajas en grasas a largo plazo han mostrado un incremento en los niveles plasmáticos de triglicéridos29. Los triglicéridos circulantes pueden provenir de la absorción intestinal de grasas en forma de quilomicrones y remanentes de quilomicrones, que pueden ser altamente aterogénicos34. En nuestro estudio con dieta a corto plazo, no observamos diferencias significativas en las concentraciones plasmáticas de triglicéridos entre el grupo control y el tratado, requiriéndose mayores investigaciones para evaluar el efecto a largo plazo de una dieta alta en grasas sobre la concentración y composición de remanentes lipoproteicos. Por otra parte, nuestros resultados no muestran una diferencia significativa en los niveles de glicemia entre los animales controles y tratados. Estudios recientes tampoco han mostrado diferencias, en respuesta a la resistencia a la insulina, entre dietas altas y bajas en grasas26,35.
Los 3 principales factores en la patogénesis de la colelitiasis son la hipomotilidad de la vesicula biliar, la sobresaturación biliar de colesterol y la cristalización de colesterol. En esencia, la sobresaturación biliar con colesterol resulta principalmente de un incremento en la secreción biliar de colesterol, y/o de una disminución en la secreción de ácidos biliares, y en menor extensión de la disminución en la secreción de fosfolípidos. Además de estos cambios relativos en los lípidos biliares, es relevante la etapa siguiente en el proceso de formación de cálculos de colesterol, denominada cristalización, ya que no siempre una bilis sobresaturada con colesterol forma cristales y posteriormente cálculos macroscópicos. El proceso de cristalización de colesterol está gatillado por la presencia de vesículas, que transportan colesterol biliar, pero que son termodinámicamente inestables. Uno de los principales factores de riesgo de la colelitiasis lo constituye un consumo excesivo de calorías en la dieta, donde el colesterol lipoproteico resultante, que eventualmente retorna al hígado, es secretado a la bilis como ácidos biliares o como colesterol libre36. En el presente trabajo estudiamos el rol de la grasa dietética como factor etiológico de la colelitiasis. En nuestro modelo experimental, observamos que una dieta rica en grasas, compuesta principalmente por ácidos grasos saturados, aumentó significativamente la concentración de colesterol biliar, sin modificar la concentración de fosfolípidos biliares. Esta saturación biliar de colesterol provocó un incremento en la concentración de colesterol en los transportadores vesículares. Mas aun, se observó un aumento en la razón colesterol/fosfolípidos en los transportadores vesiculares en las bilis de animales tratados con dieta alta en grasas. Estos transportadores vesiculares, ricos en colesterol, se pueden agregar y fusionar, favoreciendo la formación de cristales de colesterol13,14. Probablemente los ácidos grasos saturados de la dieta causaron una variación en la composición de los fosfolípidos biliares, lo cuál pudo modificar el equilibrio entre los transportadores vesiculares-micelares en la bilis, alterando la solubilización del colesterol biliar37.
Concluimos, que una dieta alta en ácidos grasos, preferentemente saturados, resulta en un incremento en los niveles plasmáticos de colesterol total y LDL-colesterol, junto con un aumento en las concentraciones de HDL-colesterol. El aumento concomitante observado en la concentración de colesterol biliar, y particularmente el incremento en la formación de transportadores vesiculares ricos en colesterol, nos indica que la ingesta de una dieta alta en grasas, preferentemente saturadas, podría contribuir a la formación de cálculos vesiculares de colesterol en una etapa temprana. Sin embargo, los mecanismos involucrados deben ser aun dilucidados.
