Uso de patrones isoenzimáticos para caracterizar la calidad genética de la semilla certificada de arroz en Venezuela

Nohelia Rodríguez*, Miriana Cerovich**, Catalina Ramis**, Fausto Miranda*, América Trujillo** y Rosana Figueroa**

¹ Producto parcial del proyecto “Caracterización del proceso de certificación de semilla de arroz en Venezuela”. Financiado por el Convenio FONACIT-FUNDARROZ-FAGRO-UCVINIA.

* Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Apdo. 4563. Maracay 2101. Venezuela. E-mail: nrrodriguez@inia.gov.ve; fmiranda@inia.gov.ve

** Profesoras. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía. Instituto de Agronomía. apdo. 4579. Maracay, estado Aragua. Venezuela. E-mail: icta@agr.ucv.ve

RESUMEN

La certificación de semillas es un sistema de multiplicación con número limitado de generaciones para preservar la pureza e identidad genética de cultivares mejorados. El diagnóstico de la cadena agroindustrial de arroz, Oryza sativa L., en Venezuela realizado en 1996, identificó problemas asociados con la pureza genética y calidad general de la semilla certificada de las variedades comerciales de arroz. El objetivo de este estudio fue determinar y cuantificar la posible contaminación de la pureza genética en las cuatro clases de semillas de arroz: Genética, Fundación, Registrada y Certificada, además de la semilla informal de los cultivares comerciales Araure 4, Cimarrón, FONAIAP 1 y Palmar. También se diseñó y validó un nuevo método para cuantificar contaminantes en muestras de semillas de arroz, cuya aplicación en el estudio demostró que la clase Registrada de la variedad Araure 4, y la semilla pirata de FONAIAP 1, presentaron 28 y 8% de contaminación en relación con el patrón isoenzimático de sus respectivas clases Genéticas. Estos resultados indican que la contaminación detectada responde a mezclas con otras variedades y/o semillas de arroces rojos, ocurridas durante su multiplicación por manejo inadecuado durante las diversas labores de campo, cosecha y post cosecha. Se demostró que la técnica de electroforesis, sola o combinada con evaluaciones morfométricas, representa un método consistente para validar la identidad y pureza genética de las variedades de arroz y sus clases de semilla certificada.

Palabras Clave: Oryza sativa L.; arroz; semillas; electroforesis; isoenzimas; certificación.

SUMMARY

Seed certification is a system based upon a multiplication of a limited number of generations to assure the genetic identity of improved cultivars. The 1996 survey on the Venezuelan rice industry, reported crop limitations associated with the genetic purity and overall quality of certified rice seed utilized at the market place. The objective of this research was to determine and quality contamination of the genetic purity of the four classes of rice seed: Breeder (BS), Foundation (FS), Registered (RS) and Certified (CS), all belonging to the seed certification system of rice, as weel as “non certified seed” (NCS) coming from the illegal rice market. Also a new method was designed and validated to quantify the genetic contamination levels of seeds. This method, applied to all samples of varieties and seed classes, showed 28 and 8% of contamination for RS of Araure 4 and NCS of FONAIAP 1, when compared to their original BS profile. These results demonstrated that the previously reported levels of contamination were associated with red rice weed, due to mismanagement of seed production fields or mechanical mixtures during seed processing, rather than a truly genetic erosion of commercial varieties. Electrophoresis by itself or in combination with morphometric evaluations proved to be a consistent method to validate identity and genetic purity of rice varieties and their classes of certified seed.

Key Words: Oryza sativa L.; rice; seed quality; seed certification; electrophoresis; isoenzymes. 

Recibido: abril 28, 2003.

INTRODUCCIÓN

Uno de los aspectos básicos de la certificación de semilla es el mantenimiento de la pureza e identidad genética de las variedades mejoradas, a fin de proporcionarle a los agricultores semillas de alta calidad (Araullo et al., 1976; Johnson, 1982; González et al., 1985). Sin embargo, durante el proceso de multiplicación la semilla puede ser contaminada con polen de otra variedad o por mezcla física, debido al manejo inadecuado de las diversas labores de campo, cosecha o procesamiento (Wang, 1988; Tinarelli, 1989). Usualmente, tal contaminación no es detectada por los análisis de rutina realizados a semillas o plántulas en los laboratorios de verificación de calidad; por lo tanto, para una evaluación efectiva, deben realizarse descripciones precisas a través de observaciones de crecimiento y desarrollo de plantas desde el estado de semilla hasta su maduración (Johnson, 1982; Payne, 1986; Lavignalle, 1996).

Los métodos basados en evaluaciones fenotípicas, requieren espacio para su ejecución y cierto tiempo para la obtención de resultados; por lo tanto, en los últimos años se han desarrollado como alternativas ventajosas, diversos métodos bioquímicos usando marcadores quimiotaxonómicos para la evaluación de la pureza genética, como parte de un programa de aseguramiento de la calidad de la semilla por su expresión casi exclusiva de la composición genética de una especie determinada (Schinkel y Gepts, 1989; Glazmann et al., 1988; Gepts y Debouck, 1991; Smith y Smith, 1992; Parra, 1994; Ortiz, 1997; Medina et al., 2000; Sengupta y Chattopadhyay, 2000; Zdenêk y Griga, 2000; Lucchese et al., 2001).

El diagnóstico de la cadena agroindustrial de arroz en Venezuela, realizado por Martínez (1996), identificó problemas asociados con la pureza genética y calidad general de la semilla certificada de arroz, lo que generalmente ha sido interpretado como “erosión genética” de las variedades comerciales. Está variabilidad marcó la necesidad de realizar este trabajo en donde se planteó como objetivo, determinar y cuantificar la posible contaminación de la pureza genética de la semilla de arroz, proveniente del sistema de producción de semilla certificada del estado Portuguesa, mediante el uso de patrones electroforéticos de isoenzimas.

MATERIALES Y MÉTODOS

En este estudio se caracterizaron los patrones isoenzimáticos de las variedades comerciales de arroz Araure 4, Cimarrón, FONAIAP 1 y Palmar, 383 de las cuatro clases de semilla reconocidas por el sistema de certificación de arroz: Genética (SG), Fundación (SF), Registrada (SR) y Certificada (SC), y de la semilla no certificada o semilla informal (SI), suministradas, en el caso de la SG por FONAIAP Barinas (ahora INIA Barinas, Centro de Investigaciones Agrícolas del estado Barinas) y el resto de las clases se obtuvo en APROSCELLO; la SI se obtuvo de los agricultores que producen semilla no autorizada.

Determinación de patrones isoenzimáticos

Para determinar las isoenzimas que permitieran diferenciar las variedades entre sí, se utilizó la metodología de Ortiz (1997), con modificaciones en cuanto a la edad de las plántulas evaluadas, basada en los estudios de electroforesis de isoenzimas en gel de almidón de Glaszmann et al., (1988). Las enzimas utilizadas fueron: fosfogluconato deshidrogenasa (PGD), beta esterasa (β-Este), sinquimato deshidrogenasa (SDH), alfa esterasa (a-Este), fosfoglucosa isomerasa (PGI), isocitrato deshidrogenasa (IDH) y malato deshidrogenasa (MDH).

a) Preparación del gel

Para la preparación del gel se uso una solución tampón del electrodo morfolina citrato, diluida en agua destilada en una relación de 1:20, hasta obtener 275 ml de solución. En un Erlenmeyer con 1/3 de la solución tampón del gel, se disolvieron 33 g de almidón de papa hidrolizado 12% mediante agitación continua. El resto de la solución fue calentada en un balón aforado hasta ebullición, cuando se añadió la solución con el almidón disuelto agitándola hasta su cristalización. El aire fue extraído al vacío y la solución, trasvasada al molde respectivo, fue cubierta con tapa de vidrio presionada para nivelar el gel y evitar pérdidas de humedad. Finalmente, el gel fue colocado a temperatura ambiente por 15 horas y almacenado en una nevera a 4ºC hasta que se realizaron las corridas electroforeticas.

b) Tamaño de muestra y preparación del extracto proteico

Para obtener el extracto de proteínas, se seleccionó una muestra de 50 semillas de la clase SG de cada una de las variedades evaluadas las cuales fueron sembradas en el laboratorio para su germinación. Entre los 18 y 23 días después de la siembra, las plúmulas de cada plántula y de cada variedad fueron cosechadas por separado y maceradas con la solución de extracción (tampón 100m Mtris, pH 7,3, 1% glutation) en  una relación de peso 1:2. El extracto obtenido se colocó sobre una franja de papel filtro Whatman # 3 para su absorción; éste a su vez fue colocado sobre el gel frío, previamente cortado a 5 cm del borde catódico, dejando una distancia aproximada de 0,5 cm entre franjas y 1 cm entre el borde del gel y la primera muestra, para evitar la mezcla de bandas durante la corrida.

c) Corrida electroforetica

El gel impregnado con la solución proteica se colocó sobre la cámara de electroforesis en un refrigerador a 4 ºC., poniendo en contacto las dos esponjas de los electrodos inmersos en el tampón con los dos polos del gel; se ajustó la intensidad de la corriente a 35 miliamperios y se realizó una corrida por 15 minutos. Posteriormente se descartaron los papeles, limpiando la zona para evitar mezclas y se unieron nuevamente las dos porciones del gel para continuar la corrida por 5 h adicionales.

d) Cortado y teñido del gel

Después de la corrida, el gel se cortó en cuatro porciones transversales de 1 a 2 mm de espesor, se descartó la superior y las tres restantes se sumergieron en una solución reveladora para cada isoenzima, luego se colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente hasta obtener buena revelación.

Determinación de la contaminación de la pureza genética de las variedades y sus clases de semillas.

Para evaluar el grado de contaminación de los patrones isoenzimáticos (PI) de las variedades y sus clases de semilla, se establecieron siete combinaciones usando plúmulas de las variedades Araure 4 y FONAIAP 1 como “plantas puras” y Cimarrón y Palmar como “plantillas contaminantes” y cuyas combinaciones mostradas en el Cuadro, fueron: 100 (99:1); 50 (49:1); 25 (24:1); 20 (19:1); 15 (14:1); 10 (9:1) y 5 (4:1).

En ambos casos se realizaron tres repeticiones de corridas electroforéticas para cada combinación y para cuantificar los porcentajes de contaminación se seleccionó la combinación dos (99:1). En la Figura 1 se presenta como ejemplo el PI y el diagrama de interpretación de Araure 4 con su respectiva contaminante para las siete combinaciones con las enzimas PGI e IDH.

Para determinar el porcentaje de contaminación de los PI, se usó la siguiente fórmula:

en donde

P = Porcentaje de contaminación.

n = Número de muestras contaminadas.

N = Número total de muestras.

Para la determinación de la proporción de impurezas mediante la distribución Binomial, se utilizó la fórmula:

en donde

P = Probabilidad de éxito = contaminación

Q = Probabilidad de fracaso = no contaminación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Realizadas las corridas electroforéticas sobre 50 plántulas individuales de cada variedad de la clase de SG, se observó que de las siete isoenzimas utilizadas, la PGD, β-Este y SDH no mostraron polimorfismo sobre las variedades evaluadas de arroz, mientras que la α Este presentó bandas muy tenues y de muy baja resolución, por lo cual fueron descartadas de las pruebas. Las tres isoenzimas restantes, PGI, IDH y MDH, mostraron uniformidad total en el patrón isoenzimático de cada variedad, permitiendo así diferenciar Araure 4, Cimarrón, FONAIAP 1 y Palmar, resultados estos que concuerdan con lo señalado por Ortiz (1997), sobre el uso de estas isoenzimas en la determinación de la pureza genética de esos cultivares, presentados en la Figura 2 con su correspondiente Diagrama.

De esta manera, la PGI mostró que Araure 4 y Palmar, al presentar una segunda banda a 2,0 cm y una tercera a 3,5 cm del origen, eran separables de Cimarrón y FONAIAP 1, porque sus bandas estuvieron localizadas a 1,8 y 3,0 cm del origen.

Los patrones obtenidos con la isoenzima IDH, mostraron que Araure 4, FONAIAP 1 y Palmar, tenían una primera banda a 2,0 cm y la segunda a 2,5 cm del origen; mientras que la Cimarrón posee una primera banda a 2,5 cm y la segunda a 3,0 cm, pudiendo así discriminarla de las tres previamente señaladas. Finalmente, la MDH, develó en Palmar, una primera banda a los 1,7 cm que permitió diferenciarla del resto de los cultivares que la presentaron a 1,0 cm del origen.

Porcentaje de contaminación

El tamaño óptimo de muestra para determinar el porcentaje de contaminación de la pureza genética fue de 50 plántulas, compuesta por 49 de la variedad evaluada y 1 contaminante (49:1). Esta combinación facilitó la estimación de la pureza genética por permitir mejor resolución de bandas de isoenzimas y alta capacidad visual de la presencia de la contaminante, asimismo es un número representativo para determinar por lo menos el 2% de contaminación en cada una de las muestras estudiadas. El PI de la SG de Cimarrón y Palmar fueron idénticos a los de sus clases de semilla, SF, SR, SC e SI. En contraste, los PI de la SG de Araure 4 y FONAIAP 1 que se presentan en la Figura 3, mostraron diferencias notables con los PI de sus clases SR y SI, respectivamente, observándose claramente las bandas contaminadas.

Porcentajes de contaminación en Araure 4 y FONAIAP 1

Los porcentajes de contaminación de Araure 4 en la SR y FONAIAP 1 en la SI, fueron calculados sobre muestras de 50 plántulas individuales, divididas en dos geles con 25 muestras cada uno, usando como testigos la SG de Cimarrón (A) y Palmar (B). Dichos testigos fueron seleccionados debido a que Cimarrón presenta bandas diferentes a Araure 4 usando las enzimas PGI e IDH y Palmar con la isoenzima MDH; sin embargo, está última presenta un PI similar a Araure 4 con las enzimas PGI e IDH, lo cual permitiría con ambas variedades determinar la presencia de contaminación en los geles.

En la Figura 4 se presenta el PI y diagrama de interpretación del primer grupo de 25 plántulas individuales de la SR de Araure 4, evaluadas con las isoenzimas PGI e IDH. En la Figura 5, se muestra el grupo complementario de 25 plántulas, evaluadas sobre un segundo gel con las mismas enzimas.

En las Figuras 4 y 5, se observa que en el primer gel usando PGI se detectó un contaminante y con la isoenzima IDH tres contaminantes. En el segundo gel se identificaron ocho contaminantes con la isoenzima PGI y seis con la isoenzima IDH; de los cuales cinco, fueron identificadas con ambas isoenzimas, por lo cual se contabilizaron una sola vez. De esta manera del total de las 50 plúmulas evaluadas para la SR de Araure 4, en los dos geles, se encontraron 13 contaminaciones correspondiendo a un 26% de contaminación y con un intervalo de confianza (P< 0,05) de 15,5 a 40%.

Para FONAIAP 1 se encontraron en total tres contaminantes en un solo gel, detectados por ambas enzimas (Figura 6). Este resultado indicó que en la SI de FONAIAP 1, tuvo 8% de contaminación genética con un rango de confiabilidad entre 0,45 y 15,5%.

Fue interesante la comprobación que los contaminantes detectados en Araure 4 y FONAIAP 1, presentaron PI diferentes a los de Cimarrón y Palmar. Este hecho hace presumir que tales contaminantes podrían corresponder a plántulas de ‘arroz rojo’ o de otras variedades mezcladas física o genéticamente en alguna fase del proceso de certificación, a pesar de que no se obtuvieron patrones híbridos definidos provenientes de cruces entre plantas, pues todas las plantas se comportaron de forma similar a los patrones de plantas homocigotas. En todo caso, la presencia de tales contaminantes desconocidos, confirma la conveniencia de complementar las descripciones morfométricas, con la caracterización de los PI de las variedades que participan en el proceso de certificación de semillas, para garantizar la pureza genética de la semilla certificada de arroz.

A la luz de los resultados obtenidos, se observó que efectivamente existen diferencias en algunas variedades entre sus clases de semillas y sus respectivas semillas genéticas, debidas principalmente a contaminaciones físicas o genéticas ocurridas en alguna fase del proceso de multiplicación (certificación), lo cual debería ser seriamente considerado por las empresas oficiales propietarias de las variedades, las empresas privadas productoras de semillas, los equipos de control cualitativo de cada empresa productora y los inspectores de semillas garantes del proceso de certificación.

CONCLUSIONES

De los resultados obtenidos, se concluye que:

- La consistencia de los patrones isoenzimáticos de las variedades evaluadas y sus clases de semilla, demostraron que los informes sobre “erosión” de la pureza genética de las variedades comerciales de arroz carecen de base científica y son altamente especulativos.

- La desviación del patrón isoenzimático de algunos lotes de semilla, respecto al patrón de su semilla genética original, estuvieron asociadas con contaminaciones debidas al manejo inadecuado de la semilla durante las diversas fases del proceso de multiplicación y/o procesamiento de semillas.

- La técnica de electroforesis, sola o en combinación con el uso de descriptores morfométricos, representa un método consistente para validar la pureza e identidad genética de las variedades de arroz y sus respectivas clases de semillas.

AGRADECIMIENTO. A la empresa de semillas Aproscello e INIA-Barinas, por el suministro de la semilla utilizada y el asesoramiento oportuno para el manejo de las fases críticas del cultivo.

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