Aída Ortiz Domínguez *, Osvaldo Gómez ** y Catalina Ramis *

1 Trabajo financiado por la Fundación para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología del estado Aragua (Fundacite) y Laboratorio de Biotecnología del Instituto de Genética. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía (FAGRO).

* Profesoras Agregado. Universidad Central de Venezuela. FAGRO. Departamento de Agronomía y Dpto. de Genética, respectivamente. Apdo. 4579. Maracay 2101, estado Aragua. Venezuela. E-mail: ortiza@agr.ucv.ve / dasilram@telcel.net.ve

** Ingeniero Agrónomo. Ejercicio privado. E-mail: ogomez@hotmail.com

En Venezuela el complejo de maleza denominado arroz rojo está (AR) conformado por 3 especies del género Oryza, Oryza sativa L. (60%), O. rufipogon Griff (39%) y O. latifolia Desv. (1%). Este trabajo de investigación tuvo como objetivo comparar 15 poblaciones de AR a través de la técnica de la electroforesis en geles de almidón y acrilamida. De semillas colectadas en fincas arroceras de los estados Portuguesa, Calabozo, Cojedes y Barinas se obtuvieron extractos crudos de plúmulas de semillas entre 5 y 14 días después de la siembra, a fin de evaluar 5 isoenzimas: isocitrato deshidrogenasa (IDH), fosfoglucosa isomerasa (PGI), a y ß esterasa (EST). Se realizaron 5 repeticiones para cada isoenzima. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis multivariado de árbol jerarquizado, utilizando la distancia Euclidiana con un criterio de agregación UPGMA en el programa CIRAD, que generó dendrogramas para cada isoenzima y uno con todas en conjunto. Los resultados mostraron que la especie O. latifolia es diferente de las demás poblaciones y/o especies bajo estudio en todas las isoenzimas evaluadas, mientras que las especies O. sativa y O. rufipogon indican una alta afinidad filogenética, por lo que algunas poblaciones de AR de estas dos especies presentan patrones de bandas similares.

Palabras Clave: Arroz rojo; Oryza sativa L.; O. rufipogon Griff; O. latifolia Desv.; electroforesis; izoenzimas.

In Venezuela, the red rice weed complex is composed of three of the gender Oryza, Oryza sativa L. (60%), O. rufipogon Griff (39%) and O. latifolia Desv. (1%). The objetive of this research was to compare 15 red rice populations using electrophoretic techniques in starch and polyacrylamide gel. Crude extracts of seed plumules, aged 14 days after sowing, obtained from seedcollected in rice farms of Portuguesa, Calabozo, Cojedes and Barinas, were used to evaluate 5 isoenzymatic system (IDH, PGD, PGI, K and 2 EST). Five repetitions of each isoenzyme were made. Data were submitted to a multivariate analysis of hierarchical tree using Euclidian distance with a criterion of aggregation UPGMA in the program CIRAD, which generated a dendograma. Results showed that the specie O. latifolia was different from the others populations and/or species in this study, for all the isoenzymatic system, whereas species O. sativa and O. rufipogon, showed a high phylogenic affinity, with similar band patterns for certain populations.

RECIBIDO: julio 16, 2003.

El arroz rojo (AR) es una maleza de importancia económica, se estima que incrementa en un 15% los costos de producción del cultivo de arroz; además, compite con el arroz y causa un efecto negativo en su calidad molinera. En Venezuela todas las zonas arroceras están contaminadas. La población promedio de AR oscila entre 12 a 17 pl m-2, sin embargo, se han detectado fincas con más de 350 pl m-2 en arroz de cosecha y 800 plántulas antes de preparar el suelo. Se estima que densidades 70 pl m-2 de AR pueden reducir hasta un 70% el rendimiento de las variedades FONAIAP 1 y Cimarrón (Ortiz, 1997; Ortiz y Budowski, 1998; Toro, 2003; Torrealba, 2001).

El análisis electroforético en la identificación varietal se ha utilizado, por la ventaja de obtener una alta resolución en la separación de proteínas, isoenzimas y otros marcadores moleculares de ADN, lo cual permite diferenciar a los cultivares de acuerdo a las fracciones del marcador molecular utilizado (Ramírez et al., 1991). La caracterización bioquímica, aplicando marcadores moleculares, ha sido usada para estudiar la afinidad filogenética en arroz, Glaszmann et al., 1988.

Existen técnicas electroforéticas que permiten diferenciar taxas, especies, subespecies, ecotipos o genotipos dependiendo del interés del investigador. Igualmente ha sido una herramienta útil para el mejorador de plantas. En lo que a producción de semilla se refiere, esta técnica también ha servido para medir el flujo de genes entre especies cultivadas y malezas, Geal et al., 2003.

En arroz se ha empleado la técnica de la electroforesis para evaluar el germoplasma del género Oryza del IRRI, usando extractos crudos de plúmulas de arroz, lo cual permitió monitorear la variación de 24 loci distribuidos en 8 cromosomas e identificar 76 alelos (Glaszmann et al., 1988).

Igualmente, esta técnica diferenció a las subespecie de arroz indica (Grupo I) de la japónica (Grupo VI); sin embargo, la javánica se incluyó en el Grupo VI; el autor señala que la agrupación de estas dos últimas razas, indicaría que la raza javánica pudiera considerarse como la forma tropical de japónica, correspondiendo esta última a la zona templada de Asia. Por otra parte, se encontraron grupos intermedios (II, III, IV, V), los cuales correspondieron con el germoplasma evaluado de los Himalayas (Glaszmann, 1987).

El estudio de la hibridación entre AR y variedades de arroz de Louisiana, EE.UU., utilizando la técnica de electroforesis de isoenzimas en geles de almidón para evaluar los cruzamientos permitieron comprobar los intercruzamientos naturales e inducidos los cuales fueron la catalasa (CAT A), isocitrato deshidrogenasa (IDH) y la fosfogluco isomerasa (PGI), tal como lo reseñan Lagevin et al. (1990)

Por otra parte, en Venezuela Rodríguez en el 2001 determinó los patrones electroforéticos de las semillas genética, registrada y fundación, certificada y no certificada, de arroz del estado Portuguesa para las isoenzimas fosfoglucosa isomerasa (PGI), isocitrato deshidrogenasa (IDH) y malato deshidrogenasa (MDH). Los resultados obtenidos permitieron evidenciar que la semilla registrada de la variedad Araure 4 y la semilla no certificada de FONAIAP 1 presentaron 28 y 8 % de contaminación con AR, respectivamente, cuando se compararon los patrones de bandas de estas categorías de semilla con los zimogramas de la semilla genética original. Esta contaminación puede haber sido por una mezcla de variedades, lo cual descartó el efecto de erosión genética en la calidad de semilla de las variedades evaluadas (Rodríguez, 2001).

El objetivo de está investigación fue caracterizar quimiotaxonómicamente algunas poblaciones de AR colectadas en siembras de arroz en Venezuela, para conocer similitudes y diferencias entre los materiales cultivados y las especies del complejo de AR.

Se colectaron semillas de diferentes poblaciones de AR en fincas arroceras de los estados Portuguesa, Cojedes, Guárico y Barinas, cuando éstas se encontraban en el estadio de madurez fisiológica. Las diásporas se colocaron en sobres, almacenándose a temperatura ambiente en el laboratorio: 28 ±2 ºC en el día y 20+2 ºC en la noche.

La selección de las poblaciones de AR en campo se basó en estudios anteriores realizados por Ortiz (1997); Ortiz y Budowski (1997); Peña y Ortiz (2001). En el Cuadro se muestra la procedencia de cada colección.

Cuadro. Especies colectadas y lugar de colección de las poblaciones de arroz rojo en las zonas arroceras de Venezuela. 2000-2001.

Alrededor de 100 semillas de cada población de AR y variedades de arroz testigo se colocaron en recipientes plásticos con papel filtro húmedo y tapa, para crear un efecto de cámara húmeda e inducir la germinación. Después de 15 d se cortaron las plúmulas, para luego ser macerados en un cuarto frío a 4 ºC, utilizando una relación 1:2 (p/v) del tampón de extracción para cada soporte.

Se emplearon dos tipos de soporte para la electrofóresis: almidón y geles discontinuos de poliacrilamina. En el caso de estos últimos se siguió el procedimiento descrito por Velásquez (2001), con un gradiente de concentración de 10% para el gel inferior y de 6% para el gel superior, usando una cámara doble Sigma, modelo 5889 y una cámara doble Bio-rad. Se usó tris glicina a pH 8,3 como tampón de corrida. La corrida se realizó en frío, con un voltaje constante de 80 v.

A diferencia de los geles de poliacrilamida, en el gel de almidón se impregnaron pequeños trozos de papel filtro con las muestras frías, siguiendo la metodología de Glaszmann et al. (1988) y las modificaciones realizadas por Boskovic et al. (1993) y Ortiz (1997). La concentración de los geles de almidón de papa utilizada fue 12%, las soluciones buffer fueron histidina/citrato para IDH y PGD y morfolina para a y b-EST y PGI.

Para evaluar las poblaciones de AR se utilizaron los sistema isoenzimáticos siguientes: 1) isocitrato deshidrogenasa (IDH, E.C. 1.1.1.42), 2) fosfoglucosa deshidrogenasa (PGD, E.C. 1.1.1.44), 3) b-esterasa (EST, E.C. 3.1.1), 4) a-esterasa (EST, E.C. 3.1.1), 5) fosfogluco isomerasa (PGI, E.C. 5.3.1.9.).

La electroforesis en almidón se realizó a 4 ºC. Se hizo una precorrida por 20 min, a 180 v, 40 m.a. y 7 watts. Posteriormente se retiraron del gel los portamuestras para continuar la corrida electroforética durante 3 a 4 h, a 180 v constante y no más de 7 watts para histidina/citrato; para la morfolina fueron 5 h, a 35 miliamperios constante y no más de 7 watts.

Finalizada la electroforesis, se descartó 3 cm del gel correspondiente al ánodo y los 5 cm del cátodo. Se procedió en seccionar el gel en capas de 2 mm de espesor, las cuales se sumergieron en la solución de revelación correspondiente a cada isoenzima (IDH, PGD, a y b-EST y PGI ) según el protocolo utilizado por Glaszmann et al. (1988). Al cabo de 1 h de incubación del gel en la solución de revelación (37 ºC en oscuridad), aparecieron bandas correspondientes a la presencia de actividad enzimática y seguidamente se determinaron los patrones electroforéticos para cada isoenzima y muestra.

A partir de los patrones electroforéticos de cada isoenzima y muestra se realizó un análisis estadístico de conglomerados de árbol jerarquizado, usando la distancia Euclidiana, con un criterio de agregación UPGMA en el paquete estadístico WinStat-IC, versión 1,0-2 Copyright IT CF/CIRAD. En este caso los valores en centímetros expresan movilidad relativa.

La Figura 1 muestra que la isoenzima a-esterasa en geles de poliacrilamida produjo polimorfismos tanto entre las tres especies bajo estudio como también entre las poblaciones de AR y variedades de arroz comerciales utilizadas como testigo, pertenecientes a la misma especie (O. sativa). En ellos, se observó que la especie O. Latifolia, representada por Portuguesa 4, se distinguió de las otras poblaciones de O. sativa y O. rufipogon por dos bandas que presentó a los 1,8 y 2,0 cm del cátodo, respectivamente.

De acuerdo con el zinmograma para la isoenzima a-esterasa observado en la Figura 1, las poblaciones de AR que mostraron el mismo patrón de bandas fueron: Cojedes 1 y 2; Portuguesa 5, 6, 7, 8 y 9; Barinas 10 (O. rufipogon) y 12; Guárico 13 y 14. Las poblaciones Cojedes 3, Portuguesa 4 (O. latifolia), Guárico 15 (O. rufipogon) y Barinas 11 (O. rufipogon) mostraron un único patrón de bandas para esta isoenzima. Así mismo, las variedades testigo FONAIAP 1 y Araure 4, presentaron idéntico zinmograma. Un dato interesante que se evidenció en esta corrida fue que las poblaciones de AR de las especies O. sativa y O. rufipogon no mostraron la banda de 2,9 cm que sí la exhibieron las variedades evaluadas y O. latifolia. Esta banda quizás pudiera utilizarse para discriminar AR en lotes de semillas usando la a-esterasa.

Figura 1. Zinmograma de la isoenzima a-esterasa en geles de poliacrilamida, de poblaciones de arroz rojo colectadas en las zonas arroceras de Venezuela

F1: FONAIAP 1 P4: Portuguesa 4 P9: Portuguesa 9 G14: Guárico 14 A4: Araure 4 P5: Portuguesa 5 B10: Barinas 10 G15: Guárico 15 C1: Cojedes 1 P6: Portuguesa 6 B11: Barinas 11 C2: Cojedes 2 P7: Portuguesa 7 B12: Barinas 12 C3: Cojedes 3 P8: Portuguesa 8 G13: Guárico 13.

En la Figura 2 se observa que las poblaciones de AR que mostraron similar patrón de bandas con b-esterasa fueron: Cojedes 1 y 2; Portuguesa 6 y 7; Barinas 11 y 12 y Guárico 13, 14 y 15, así mismo, Portuguesa 8 y 9. Los AR Barinas 10, Portuguesa 5, Portuguesa 4 y Cojedes 3, y las variedades FONAIAP 1 y Araure 4 formaron zinmogramas únicos.

Es importante resaltar que la banda ubicada a los 3,6 cm de la isoenzima b-esterasa solamente la presentaron las poblaciones de AR con excepción de O. latifolia, por lo que podría utilizarse como marcador molecular para diferenciar el AR de las variedades en la certificación de semilla de arroz, de manera similar a la banda de 2,9 cm de la a-esterasa.

La isoenzima PGD produjo 4 grupos de patrones de bandas (Figura 3), en el primero se encontraron las variedades FONAIAP 1 y Araure 4 conjuntamente con los AR Cojedes 1, 2 y 3; Portuguesa 6, 7, 8 y 9; Barinas 11 y 12, y Guárico 13, 14 y 15. Los otros 3 grupos estuvieron conformados por las poblaciones de AR: Portuguesa 4 (O. latifolia), Portuguesa 5 y Barinas 10 (O. rufipogon) que formaron un patrón único de bandas cada una.

La isoenzima IDH produjo polimorfismos donde se distinguieron claramente las variedades de arroz de las poblaciones de AR (Figura 4). Exhibieron el mismo patrón de bandas los AR Cojedes 1, 2 y 3; Portuguesa 5 y 6; Barinas 10 y Guárico 13 y 15. Igualmente, Portuguesa 7, 8 y 9 exhibieron el mismo zinmograma; también Barinas 12 y Guárico 14 tuvieron igual patrón de bandas. La población de Portuguesa 4 (O. latifolia) y Barinas 11 (O. rufipogon) mostraron un patrón de banda único.

La banda ubicada a los 2,1 cm estuvo presente en los AR y ausente en las variedades y el AR Portuguesa 4 (O. latifolia), por lo que pudiera utilizarse la isoenzima IDH como marcador molecular en el control de calidad genético en la certificación de semilla de arroz cuando se encuentra contaminada con los AR de las especies O. sativa y O. rufipogon al igual que la a y b-esterasa.

Resultados similares a éstos obtuvieron Ortiz et al. (2002), cuando utilizando esta misma IDH lograron diferenciar a las variedades FONAIAP 1, Araure 4 y Zeta 15 de los AR, con una banda que se presentó a los 2,2 cm en las variedades y a los 2,5 cm en los AR. No hubo separación entre Araure 1 y Cimarrón y los AR con esta isoenzima, pues mostraron la banda en la misma posición.

Figura 2. Zinmograma de la isoenzima b-esterasa en geles de poliacrilamida de variedades de arroz y poblaciones de arroz rojo colectadas en las zonas arroceras de Venezuela.

F1: FONAIAP 1 P4: Portuguesa 4 P9: Portuguesa 9 G14: Guárico 14 A4: Araure 4 P5: Portuguesa 5 B10: Barinas 10 G15: Guárico 15 C1: Cojedes 1 P6: Portuguesa 6 B11: Barinas 11 C2: Cojedes 2 P7: Portuguesa 7 B12: Barinas 12 C3: Cojedes 3 P8: Portuguesa 8 G13: Guárico 13.

F1: FONAIAP 1 P4: Portuguesa 4 P9: Portuguesa 9 G14: Guárico 14 A4: Araure 4 P5: Portuguesa 5 B10: Barinas 10 G15: Guárico 15 C1: Cojedes 1 P6: Portuguesa 6 B11: Barinas 11 C2: Cojedes 2 P7: Portuguesa 7 B12: Barinas 12 C3: Cojedes 3 P8: Portuguesa 8 G13: Guárico 13.

dientes a las enzimas formadas por cadenas polipeptídicas similares y una tercera banda en el punto intermedio entre las otras dos, perteneciente a una enzima formada por las cadenas polipeptídicas diferentes, producto de cada gen.

En este orden de ideas, para el gen Pgi-1 se observaron 3 alelos diferentes correspondientes a las bandas de 2,6; 3,3 y 3,7 cm de movilidad relativa, este último sólo se apreció en la especie O. latifolia. Para el gen Pgi-2 también se observaron 3 alelos, concernientes a las bandas de 0,9; 1,2 y 1,8 cm de movilidad relativa; la banda de 1,2 cm no se presentó en los cultivares, tal como observaron Ortiz et al. (2002); la banda de 1,8 cm apareció solamente en O. latifolia.

F1: FONAIAP 1 P4: Portuguesa 4 P9: Portuguesa 9 G14: Guárico 14 A4: Araure 4 P5: Portuguesa 5 B10: Barinas 10 G15: Guárico 15 C1: Cojedes 1 P6: Portuguesa 6 B11: Barinas 11 C2: Cojedes 2 P7: Portuguesa 7 B12: Barinas 12 C3: Cojedes 3 P8: Portuguesa 8 G13: Guárico

Figura 5. Zinmograma de la isoenzima fosfoglucosa isomerasa en gel de almidón, de poblaciones de AR y variedades de arroz colectadas en las zonas arroceras de Venezuela.

F1: FONAIAP 1 P4: Portuguesa 4 P9: Portuguesa 9 G14: Guárico 14 A4: Araure 4 P5: Portuguesa 5 B10: Barinas 10 G15: Guárico 15 C1: Cojedes 1 P6: Portuguesa 6 B11: Barinas 11 C2: Cojedes 2 P7: Portuguesa 7 B12: Barinas 12 C3: Cojedes 3 P8: Portuguesa 8 G13: Guárico

Las bandas híbridas de las cadenas polipeptídicas pertenecientes a cada gen serían las de 1,8 y 2,2 cm de movilidad relativa, y de 2,6 cm para O. latifolia. A diferencia del resto del grupo, en los casos de las muestras Cojedes 3, Portuguesa 7 y Guárico 14 se observaron 5 bandas evidenciando así la presencia de individuos heterocigotas para uno de los loci o, a la mezcla de dos genotipos homocigotas distintos. Por otra parte, se observó otra zona más anódica en la cual se encontraron dos bandas para todas las muestras a 4,2 y 4,4 cm, y una de 5,0 cm de movilidad relativa para O. latifolia; esta zona no interactúa con la anteriormente descrita, lo que sería un indicativo de que correspondería a la expresión de un gen en otro comportamiento subcelular (Endo y Morishma, 1987).

La PGI logró diferenciar 7 grupos, el primero formado por la mayoría de las poblaciones de AR, Cojedes 1 y 2; Portuguesa 5, 6, 8 y 9; Barinas 10, 11 y 12 y Guárico 13 y 15. Un segundo grupo por Portuguesa 7 y Guárico 14, mientras que los otros estuvieron formados por una sola población o variedad que mostró un patrón único de bandas para la PGI.

Ortiz et al. (2002) encontraron que la PGI produjo mayor polimorfismo en las variedades de arroz y AR que las enzimas EST, IDH, PGD y SDH. Así mismo, hallaron que el patrón de bandas de las variedades Cimarrón, FONAIAP 1 y Araure 1 fueron similares y mostraron 3 bandas a 1, 1,9 y 3,3 cm, respectivamente. Sin embargo, Araure 4 y Zeta 15 exhibieron 3 bandas a 1, 2,4 y 4 cm, respectivamente. Los AR mostraron patrones diferentes a las variedades de arroz, con excepción de Cojedes, el cual mostró un polimorfismo similar a Cimarrón, FONAIAP 1 y Araure 1. Estos autores señalaron que las poblaciones de AR Portuguesa 3 y Portuguesa 2 pudieron haber sido heterocigotas o contener una mezcla de 2 genotipos ya que presentaron 5 y 7 bandas, respectivamente.

En el dendograma conjunto de todas las isoenzimas evaluadas, mostrado en la Figura 6, se aprecia la separación de la especie O. latifolia, representada por el AR Portuguesa 4, del resto de las poblaciones, tal como se había observado en los análisis individuales. O. latifolia se separó con la mayor distancia euclidiana, lo que la ubicó como la de menor afinidad filogenética con las otras poblaciones de AR y variedades de arroz.

La misma (Figura 6) muestra que con una distancia euclidiana de aproximadamente 2,4 las poblaciones de AR y variedades de arroz formaron los siguientes grupos: 1) Portuguesa 4; 2) Cojedes 3; 3) Portuguesa 5; 4) Barinas 10; 5) FONAIAP-1; 6) Portuguesa 7 y Guárico 14; 7) Barinas 12 (O. rufipogon); 8) Cojedes 1 y 2, Portuguesa 6 y Guárico 13; 9) Barinas 11 (O. rufipogon); 10) Portuguesa 8 y 9; 11) Guárico 15 (O. rufipogon) y 12) Araure 4.

La presencia de individuos heterogéneos en el campo con una base genética amplia, confieren a estas poblaciones una mayor resistencia a condiciones adversas, así como a los medios de control existentes. Además, la siembra de semillas provenientes de individuos de este tipo traerá como consecuencia la diseminación de los genes responsables del color rojo del pericarpio del grano, completamente indeseable en el arroz de mesa, ya que esta asociado al quebrado del mismo y pérdida del grado del producto final.

La afinidad filogenética mostrada entre los AR y variedades resulta en una limitante para la liberación de arroces transgénicos ya que los genes insertados en el genoma del arroz pueden pasar al AR a través del flujo de genes intra e inter especies dando como consecuencia la pérdida de las bondades agronómicas conferidas a estos cultivares (Olofsdotter et al., 1999).

Figura 6. Dendrograma de los patrones electroforéticos de las isoenzimas a y b EST, PGD, IDH y PGI, de variedades de arroz y de poblaciones de arooz rojo colectadas en las zonas arroceras de Venezuela.

- Las isoenzimas a y b EST, PGD, IDH y PGI permitieron separar a la especie O. latifolia, de O. sativa y O. rufipogon, y definieron una distancia filogenética cercana entre las poblaciones de AR de las especies O. sativa y O. rufipogon y las variedades FONAIAP 1 y Araure 4.

- Las bandas detectadas con a-esterasa, a 2,9 cm y con b-esterasa a 3,6 cm, pudieran utilizarse como marcadores moleculares para ser usados en la producción de semilla certificada, con el fin de discriminar lotes con presencia de AR.

Los autores expresan su agradecimiento a los productores de arroz, por permitido colectar las muestras de semillas en sus fincas para esta investigación. Así mismo, se agradece al Ing. Carlos Marín (INIA) por su asesoría en los análisis estadísticos.