Aislamiento y caracterización de cepas de Bacillus spp. Productoras de enzimas proteolíticas para la producción de hidrolizados de proteínas. Isolation and characterization of strains of Bacillus spp. Production of proteolytic enzymes for the production of protein hydrolysates. Manuel Pérez Quintana Universidad de Matanzas Cuba Grethel Milián Florido Universidad de Matanzas Cuba Gilfredo Alfonso González Instituto de Ciencia Animal Cuba Roberto González Castellanos Universidad de Matanzas Cuba Raúl Piad Barreras Universidad de Matanzas Cuba Gerardo Ascunce del Sol. Planta Productora de Conservas y Vegetales ``Libertad´´. Colón Cuba RESUMEN: Fueron aisladas 100 cepas de Bacillus spp. productoras de proteasas, de ellas se seleccionó la más eficiente por su halo de hidrólisis en medio agar nutrientecaseína. Se estudió el medio y las condiciones de cultivo sobre la producción de proteasas y su actividad con el fin de optimizar las condiciones de producción de la enzima. Para ello se utilizó un Diseño de experimento factoriales y un Compuesto Central Rotativo; los resultados fueron tratados por el método matemático de la Superficie de Respuesta. Se obtuvieron valores óptimos de actividad de enzimática 12 U Anson con el medio y las condiciones de cultivo óptimas. El extracto enzimático producido (ESS) bajo condiciones óptimas fue probado para la producción de hidrólizados de proteínas de sangre total bovina, con una razón de hidrólisis con valores entre 30 y 35%. Revista Avanzada Científica Vol. 1 No. 3 Año 1998 Palabras claves: Aislamiento, Bacillus spp., optimización, medio de cultivo, hidrólisis enzimática. ABSTRACT: In this work 100 Bacillus spp. strains to produce proteolytic enzymes were isolated. The more efficient strain was selected by means of its hydrolysis halo in agar nutrient casein. The medium and the culture conditions for producing the proteolytic enzymes extract (ESS) under the best conditions were optimised. For that reason a factorial desing combination (fraccionary factorial and central composite desing) was utilized. The results were presented by a surface response method. A optimal enzymatic activity of 12 U Anson in the EES was ontained. The EES was used to make hydrolysis from bovine blood and a yield of 30 to 35 % of hydrolysis degree was reached. Key word: Isolation, Bacillus spp., optimization, culture medium, enzymatic hydrolysis. INTRODUCCIÓN: Las enzimas constituyen un grupo de biomoléculas de alta actividad catalítica y especificidad de acción que han ido alcanzando un notable incremento aplicativo en la industria manufacturera y procesadora, en particular la industria alimenticia (knorr et al., 1985). La utilización de las enzimas microbianas como sustitutas de las obtenidas a partir de organismos superiores es una tendencia creciente a nivel mundial (frost y Moss, 1987), dado el número de ventajas que presentan estas fuentes, entre las que deben señalarse: Mayor facilidad de escalado de las producciones y por tanto más posibilidad de satisfación de las demandas, posibilidad de aumento de la productividad mediante mejoramiento de cepas, mayor facilidad de cultivo en ambientes controlados y menor duración de los ciclos de producción. De estos biocatalizadores industriales, las proteasas representan el 59% del total de las enzimas que ofrecen un mercado mundial valorado en más de 500 millones de dólares anuales (Godfrey et al., 1987). Sus usos en la industria alimenticia incluyen la manufactura de quesos, tenderización de carnes, producción de helados, cerveza, desarrollo de sabores y modificación de la viscoelasticidad del pan (Loffer, 1986). Igualmente son muy valoradas en la producción de detergentes para lavandería y como limpiadores de sistemas de ultrafiltración (Smith et al., 1986). Destaca además su importancia clínica en la producción de hidrolizados de proteínas para dietas nutricionales y terapéuticas (Adler-Nissen, 1986). Las proteasas obtenidas a partir de bacterias del género Bacillus representan las de mayor significado aplicativo en la biotecnología mundial (Doi, 1991). De ellas, resalta por su gran diversidad de utilización la subtilisina (Subtilopeptidasa A.) (loffer, 1986; Smith et al., 1986 y Blinkousky et al., 1994), serino-proteasa secretada durante una fase de su crecimiento por el B. subtilis y otros microorganismos relacionados. Esta proteasa se produce fundamentalmente a escala industrial para su Revista Avanzada Científica Vol. 1 No. 3 Año 1998 utilización en formulaciones detersivas, en la manufactura de hidrolizados proteicos a partir diferentes fuentes proteicas (Gutman et al., 1992). Ha sido tradicional desarrollar los estudios para optimizar los procesos de producción de enzimas mediante la variante experimental un factor un tiempo. Es de destacar que cuando se emplean estos protocolos no se tienen presentes las interacciones entre variables independientes. Es por ello que en la actualidad la tendencia sea tratar los problemas de las producciones microbianas y los estudios bioquímicos en general, aplicando las técnicas del Diseño Estadístico de Experimento que se emplean en las especialidades de Ciencias Técnicas con los que es posible considerar estas interacciones. Los hidrolizados enzimáticos de proteínas de alta calidad, por su parte, tienen un amplio uso como componente terapéutico y nutricionales en múltiples organismos superiores registrando un gran incremento en los últimos años. El presente trabajo tiene como objetivos: · Aislar y clasificar cepas productoras de proteasas. Optimizar a nivel industrial el ESS a partir de la cepa seleccionada. Utilizar el ESS para la producción de hidrolizados proteicos a partir de sangre bovina total. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento de cepas de Bacillus sp productoras de enzimas proteolíticas: Fueron aisladas 100 cepas de bacterias pertenecientes al género Bacillus a partir de muestras de leche entera y desechos colectados en la Planta Productora de Conservas y Vegetales "Libertad"; Colón, Matanzas. Se eliminaron todas las formas vegetativas de las muestras utilizadas para el aislamiento por tratamiento térmico a 100 0C por un tiempo de 5 minutos. Posteriormente se hicieron diluciones seriadas y se inoculó 0.1 ml de suspensión de esporas en placa petri que contenía 20 ml de medio de cultivo agar nutriente-caseína pH 7.5. La incubación se desarrolló en una incubadora eléctrica SMIC a 40 0C de temperatura. Se midieron los halos de hidrólisis sobre caseína a las 12, 24, 36 y 48 horas. Las cepas de mayor halo fueron purificadas mediante técnica de agotamiento en placas y conservadas en solución salina estéril ( Pelczar, 1979 ) en un Banco de cepas perteneciente al Laboratorio de Biotecnología de la Universidad de Matanzas. Medio y condiciones de cultivo: Se utilizó para el crecimiento microbiano y producción de enzima un medio de cultivo con los siguientes componentes constantes: Na2HPO4 (MERK) y Peptona Bacteriológica (LABIOFAM). Se utilizaron como variables independientes para el diseño los componentes mayoritarios siguientes: fuente de nitrógeno (autolizado de levadura forrajera); fuente de carbono (mieles finales de la industria azucarera) y fuente de calcio (cloruro de calcio MERK). Fueron añadidos 100 mL de medio líquido en erlenmeyers de 1000 mL de capacidad total. La esterilización se hizo en una autoclave vertical a 121 0C y 1.1 atmósfera de presión en un tiempo de 20 minutos. Las corridas experimentales se desarrollaron en Zaranda Rotatoria INNOVA 1430. Revista Avanzada Científica Vol. 1 No. 3 Año 1998 Con el objetivo de optimizar la temperatura de producción de enzimas, la misma fue variada en un rango de 10 a 50 0C a intervalos de 10 0C. Asimismo, se estudio la influencia del pH del medio de cultivo sobre el mismo parámetro, para ello se varió con el empleo de un buffer fosfato el pH entre valores de 3.0 hasta 9.0 a intervalos de 1.0 unidad. Diseño experimental y tratamiento estadístico de los resultados. Se hizo un diseño de experimento Compuesto Central Rotativo y Ortogonal (López, 1987), donde se seleccionaron como variables independientes: la fuente de nitrógeno, la fuente de carbono y la fuente de calcio, con los niveles 20 y 60 g/litro para la primera variable, 50 y 100 g/litro para la segunda y 1 y 2 g/litros para la tercera, como variable de respuesta fue seleccionada la actividad proteolítica. Los niveles incluidos en este experimento obedecen a consulta en la literatura especializada (Frost 1987) y a la experiencia en el laboratorio. El número de experimentos a realizar (Nexp.), para este tipo de Diseño se determinó según la siguiente expresión (Planes, 1988) : Nexp.= 2k x 2k x No. Donde: k = Número de variables independientes. 2k = Número de puntos estrellas del experimento. No = Número de puntos en el centro del experimento. El valor de No depende del número de variables independientes, Según la literatura (Askhnazarova 1982) este valor para 3 variables es 2. Nexp.= 23 + 2 (3) + 2 Nexp.=16 experimentos Los resultados fueron procesados según el metodo de la Superficie de Respueta (Krzysztof, 1994). Determinación de la actividad enzimática. Para la determinación de la actividad proteolítica se procedió según técnica analítica reportada por Anson, 1973, utilizando hemoglobina bovina desnaturalizada como sustrato. Se consideró una unidad de Actividad proteolítica (U), la cantidad de proteína hidrolizada en un minuto por un mL de extracto enzimático. Obtención del extracto enzimático a nivel industrial: La producción de este extracto enzimático se desarrolló en una escala industrial, en un fermentador Biolaffite de 1000 L de capacidad total. Uso del extracto de enzimas proteolíticas para la producción de hidrolizados enzimáticos de sangre bovina: El ESS fue empleado para la producción de hidrolizados enzimáticos de sangre total bovina. Para ello se uso la variante tecnológica de los laboratorios LABIOFAM S.A, sustituyendo la enzima papaína (proteasa de la Carica papaya) por el ESS. RESULTADOS Y DISCUSIÓN: A todas las cepas crecidas en medio agar nutriente caseina se les midió el halo de hidrólisis a las 48 horas, de ellas se seleccioneron las cuatro de mejor comportamiento para el estudio cinético en medio sólido. Halos de hidrólisis frente a caseína de las 4 cepas de Bacillus sp de mejor comportamiento seleccionadas: Revista Avanzada Científica Vol. 1 No. 3 Año 1998 Se desarrolló un estudio cinético de la capacidad de hidrolizar la caseína de las 4 cepas con actividad proteolítica seleccionadas. Se midieron los valores de halos a la 12, 24, 36 y 48 horas. En la tabla 1 se presentan los resultados de estas 4 cepas de mejor comportamiento. Tabla 1. Valores de halos de hidrólisis frente a la caseína (mm) de las cuatro cepas seleccionadas. Cepa 12 horas S 24 horas S 36 horas S 48 horas S E-25 3.30e 0.15 20.43c 2.45 25.50b 3.34 24.50b 3.77 E-44 6.78d 0.16 24.05b 2.08 27.00a 3.05 27.02a 4.03 E-18 3.90e 0.20 16.50d 2.25 21.80c 3.33 21.84c 4.24 E-03 3.05e 1.14 16.00d 2.54 20.25c 3.56 20.24c 3.98 a,b,c,d,e Medias con letras diferentes en los supraíndices difieren a P<0.01 (Duncan, 1955). Se observa un mayor halo de hidrólisis en las cepas E-25 y E-44, con 25.5 y 27,0 mm respectivamente a las 36 horas de incubación, las que difieren significativamente de las tres restantes para Duncan P>0.05%. Este resultado se compara favorablemente con el que obtuvo Roy (1991), quien desarrolló un Programa donde aisló 100 cepas de Bacillus sp. productoras de proteasas. En su trabajo encontró un máximo halo de hidrólisis frente a caseína de 23.5 mm al cabo de 40 horas a 38 0C. Resultados obtenidos con el uso del diseño Compuesto Central Rotativo Ortogonal. Según el Diseño compuesto Central rotativo se hicieron 16 experimentos. Cada uno de estos experimentos se desarrolló con réplicas la variable respuesta medida fue la actividad proteolítica. Los resultados fueron tratados por el método de la Superficie de Respuesta. Con este método se representan los valores promedios de actividad enzimática (U) obtenidos cuando se ensayaron las diferentes experimentos. Se grafican los resultados (contactar con el autor para enviar gráficas), y se obtiene la siguiente combinación de variables independientes como óptima: miel final 80 g/l; autolizado de levaduras 40 g/l y cloruro de Aclcio 1.75 g/l con un valor de actividad enzimática de 96.69 U Anson. Es de destacar que en 1993, Haltrich y colaboradores obtuvieron un incremento de 330% en la producción de xylanasa con una cepa salvaje de S. Commune, mediante la optimización de la formulación del medio y de las condiciones de fermentación, tanto a nivel de frascos agitados como en fermentadores de banco y piloto, aplicando una combinación de técnicas de diseño de experimento y superficie de respuesta. Esos resultados superon con creces a los obtenidos por los medios tradicionales de optimización e incluso superiores a los logrados con el uso de técnicas de mejoramiento genético de cepas (Haltrich et al., 1993). Por otra parte en un proceso para la producción de enzimas por fermentación es necesario tener en cuenta el fenómeno de inducción y represión catabólica (Mandels et al. 1962). Muchas enzimas son producidas en cantidades, solo en presencia de inductores específicos. Un ejemplo de estos componentes Revista Avanzada Científica Vol. 1 No. 3 Año 1998 inductores es el autolizado de levaduras. En el presente trabajo se reportan mayores niveles de actividad proteolítica cuando se utilizaron 60 g/litro de autolizado de levadura en el medio de cultivo que cuando se emplearon 40 g/L. Este resultado coincide con lo reportes de Frost y Moss en 1993. La represión catabólica, por su parte, es el proceso donde la síntesis de la enzima es suprimida por la presencia de fuentes de carbono fácilmente metabolizables. La glucosa es el más común metabolito represor (Demain 1992), esta represión puede ser prevenida, con el diseño de medios de cultivo carentes de estas fuentes de carbono. La miel final, usada en este trabajo como fuente de carbono presenta altos niveles de glucosa. Ello explica los resultados más bajos en actividad enzimática cuando se incorporaron al medio de cultivo 100 g/L de esta materia prima. Estudio cinético de temperatura y pH. La temperatura óptima para la producción de la enzima por la cepa seleccionada se determinó a los 40 0C con un valor de actividad de 97.34 U Vavrova, 1990 obtuvo una razón mayor en la síntesis de proteasa de Bacillus megaterium a una temperatura de 28 0C, mientras que la mayor razón de crecimiento específico la anotó a los 42 0C. Por su parte Frost, 1993 encontró una mayor producción de proteasas de una cepa Bacillus sp. a 40 0C, mientras reportó una temperatura óptima para el crecimiento de esta misma cepa a 38 0C, este resultados coincide con los reportados en este trabajo. A pH 8.0 se obtuvieron los valores más elevados de actividad por la cepa en estudio con 97.43 U Es de destacar que el crecimiento de las células microbianas esta muy influenciado por el pH. En muchos casos, al igual que para la temperatura el pH donde se obtiene la mayor razón de crecimiento específico difiere del pH óptimo para la síntesis de la enzima por la misma cepa. Keay et al 1970, obtuvo un valor óptimo de actividad proteasa-serina a partir de Bacillus licheniformis a un pH de 10.5, los mejores resultados de crecimiento para esta especie los encontró a un pH de 8.5. Aunstrup 1980, obtuvo resultados similares a los reportados en este trabajo, investigando con una cepa de Bacillus sp, él reportó valores óptimo de actividad a un pH de 8.0. BIBLIOGRAFIA: · Adler-Nissen.J. "Enzimatyc Hydrolisis of Food Proteins" Elsevier Applied Science. /New York/:104-271, (1986). · Anson, M. L. J. Physiol. 20, 1973. · Aunstrup, K. "Proteinase". 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