Resumen de Application of casa technology and multivariate analysis to optimize the semen evaluation in domestic and wild species
La reproducció assistida en l’àmbit veterinari En l’actualitat, la majoria de les espècies d’interès ramader es reprodueixen utilitzant alguna tècnica de reproducció assistida, sent la inseminació artificial (IA) la més utilitzada. La pràctica de la IA implica les següents etapes: recol·lecció del semen, avaluació del a qualitat seminal, dilució, transport (amb refrigeració o congelació) i inseminació.
La recol·lecció del semen es pot realitzar per masturbació (rabosa), vagina artificial (bou), electró-ejaculació (quan altres mètodes no són factibles), derivació del vas deferens (alpaca) o recuperació epididimària (particularment d’animals d’alt valor que presenten problemes de ejaculació o al poc temps post-mortem ).
L’anàlisi tradicional de la qualitat seminal inclou l’avaluació de la concentració i la mobilitat (total i progressiva), paràmetres en els que es basa el càlcul del nombre de dosis que es pot produir a partir d’un ejaculat concret. Aquesta valoració es realitza, habitualment, utilitzant l’aproximació del 5% més pròxim, el que significa que per tal d’assegurar la utilitat de les dosis es sol acudir a un excés de cèl·lules, el que redunda en una deficient productivitat. Val a dir que amb l’ús de la tecnològica CASA (computer assisted semen analysis, veure més endavant), s’ha afegit el càlcul de la cinètica, i encara, de la morfometria com a nous paràmetres més sensibles i reproduïbles.
La dilució del semen és un element clau i ha comportat a la definició de medis de dilució específics tant respecte de la espècie com del sistema de preservació escollit. A la fi l’objectiu és el manteniment de la qualitat espermàtica durant el major temps possible, el que es tradueix en una major distància potencial de transport. Òbviament, la millor de les solucions és la criopreservació (temps il·limitat, si més no teòricament), encara que la refrigeració resulta més pràctica quan la vàlua genètica dels individus no justifica la inversió requerida per a la criopreservació.
Finalment, la inseminació implica el desenvolupament de cànules de inseminació adequades a cada espècie.
La IA ha facilitat la disseminació ràpida i universal del material genètic a partir d’un nombre relativament menor (encara que assegurant la necessària i desitjable biodiversitat) de sementals. Potser, l’espècie on més evident s’ha fet aquest fenomen ha estat la porcina, on de cada ejaculat s’obtenen entre 10 i 20 dosis de inseminació.
Com s’ha esmentat anteriorment, la introducció (quan no la substitució) de sistemes automatitzats d’avaluació espermàtica basats en sistemes CASA va suposar una revolució en el conjunt del procés productiu. Ara bé, val a dir que aquesta tecnologia ha estat generalment implantada sense una anàlisi crítica de les seus limitacions i dependències en diversos factors metodològics, el que, com es comentarà més endavant, constitueix un dels eixos vertebradors de la present Tesi Doctoral.
En qualsevol cas, els sistemes CASA permeten l’anàlisi d’una gran quantitat de cèl·lules en un temps molt curt, aportant també una considerable bateria de dades quantitatives sobre la cinètica o la morfometria espermatozoide a espermatozoide, amb la qual cosa és possible optimitzar la quantitat i la fiabilitat de les dosis seminals produïdes.
Finalment s’ha de fer menció de la importància dels sistemes CASA en la definició de programes de Control de Qualitat en el procés de producció de dosis d’inseminació.
L’analítica Seminal Recentment, el nostre grup de recerca ha participat en l’edició y publicació de dos números especials de les revistes Asian Journal of Andrology (Vol. 16, número 6 de 2016) i Reproduction Fertility and Development (Vol. 30, número 6 de 2018) en els que se ha posat al dia el coneixement general sobre el significat de l’anàlisi seminal en allò referent a la morfologia/morfometria i a la mobilitat/cinemàtica dels espermatozoides en una gran varietat d’espècies. Alguns dels treballs constitutius de la present Tesi Doctoral han format part dels esmentats números especials.
Com a resum, val a dir que, una vegada esgotat el significat de la valoració subjectiva de la qualitat seminal, el present i el futur passa per l’ús de les tècniques CASA, i no ja aquelles que han estat sent utilitzades en les darreres èpoques sinó en altres que marquen el camí futur, com és el cas de la refent a la valoració de la mobilitat amb l’ús de microscòpia làser, en un treball també presentat pel nostre grup.
Un element que ha quedat perfectament establert en el conjunt de treballs publicats suposa un canvi substantiu de paradigma conceptual respecte de què és un ejaculat. Val a dir que fins temps recents es va considerar que la considerable població (milions i milions) d’espermatozoides estava format per cèl·lules “equivalents” amb un objectiu comú: ser el que finalment fecundés l’oòcit. La comprovació del fet que el conjunt d’espermatozoides s’agrupa en subpoblacions ben definides, en quant a les seus característiques cinètiques i/o morfomètriques obre el camí cap a una visió més cooperativa. A un nivell col·loquial e podria dir que s’ha passat de pensar en una marató a pensar en un joc d’equip. Endemés, s’ha vist que la distribució sub poblacional és diferent entre diferents individus, el que sembla indicar diferents estratègies que es poden entendre dins d’un altre paradigma, qual és el de la competència espermàtica entre diferents ejaculats. És cert que encara no coneguem el paper de les diferents subpoblacions o, dit d’altra forma, que no coneguem l’esport que es juga. Però el futur haurà d’anar en eixa direcció. Els treballs que composen aquesta Tesi Doctoral intenten aportar un nou esglaó en aquest sentit.
Objectius generals L’eix vertebrador de la present Tesi Doctoral omplir el buit detectat en la literatura respecte de l’optimització dels protocols d’avaluació espermàtica. Tan sols en el cas de l’espècie humana, s’ha fet un esforç en aquest sentit el que s’ha traduït en l’elaboració de successius manuals per part de la OMS (Organització Mundial de la Salut). De tota manera, fins i tot, en el cas humà coexisteixen protocols alternatius reconeguts per altres organitzacions internacionals.
Centrant-nos-en la tecnologia CASA, per tal d’obtindre dades quantitatives fiables cal definir protocols òptims per a l’avaluació de cada paràmetre seminal que asseguren la consistència i universalitat de l’aplicació dels resultats. Ara bé, hem constatat que aquesta mena de treball d’estandardització dels protocols encara no s’ha realitzat d’una forma integrativa, la qual cosa configurarà el primer objectiu general de la present Tesi Doctoral. Tres són els aspectes fonamentals a considerar en el procés d’optimització que es proposa per a l’ús dels sistemes CASA: el tipus i la profunditat de les càmeres de recompte, el medi de dilució i la freqüència de captura de les imatges. En aquest darrer aspecte, la nova disposició de tecnologia de vídeo a preus assumibles ha mostrat que el increment en la susdita freqüència implica una variació molt significativa en algun dels paràmetres cinètics. Els aspectes tècnics relatius a l’estudi de la morfometria espermàtica no s’inclouen en la present Tesi Doctoral, per quant constitueixen l’objectiu d’altra Tesi Doctoral en marxa en el nostre grup de recerca.
El segon objectiu general es centra en l’estudi de l’estructura subpoblacional en diferent espècies i condicions, així de com influencien en la mateixa les diferents condicions tècniques i operatives avaluades.
Objectius específics 1. Comparar diferents aproximacions estadístiques per a l’avaluació de la morfometria espermàtica del bou amb la finalitat de definir el mètode més útil i precís i d’aplicar-lo a l’avaluació de diferents ejaculats i mostres rere congelació i descongelació del mateix individu.
2. Determinar l’efecte de la freqüència de captura de imatges sobre l’avaluació dels paràmetres cinemàtics en els espermatozoides de porc i de la seua importància en la correcta determinació de la estructura de subpoblacions d’acord a la cinètica.
3. Determinar l’efecte del temps de captura en l’avaluació de la mobilitat i la cinètica en semen de porc per tal d’optimitzar el protocol d’anàlisi de les mostres.
4. Col·laborar en la definició i l’establiment del coneixement del significat de la morfometria espermàtica amb l’ús de la tecnologia CASA-Morph. Aquest objectiu es va completar sent un dels Editors Invitats del número especial corresponent de la revista Asian Journal of Andorlogy de 2016, abans esmentat.
5. Analitzar, en semen de bou, la distribució espermàtica diferencial i les característiques de mobilitat i cinètica a llarg de tres càmeres comercials de recompte (CellVu®, Leja® i Makler®), així com l’efecte de dos medis comercials de dilució (Biladyl® i Andromed®), amb la finalitat d’optimitzar l’ús dels sistemes CASA-Morph.
6. Avaluar la mobilitat i la cinètica, mitjançant un sistema CASA-Mot, en diferents races de gos (Canis familiaris), per tal de definir si la perllongada selecció artificial en aquesta espècie ha conduït a un significant procés de diferenciació gamètica entre races.
7. Caracteritzar la cinemàtica i la morfometria espermàtica del caiman (Caiman crocodilus fuscus) i determinar l’existència de subpoblacions al si del ejaculat.
Metodologia Mostres La procedència de les mostres va ser: Bou (Bos taurus), de la raça Holstein: Xenética fontao S.A. (42º58’ N, 7º34’ O), Lugo, Espanya (Objectius 1 i 5).
Porc (Sus scrofa), de la raça Pietrain i de les seus línies genètiques derivades: Semen Cardona, S.L. (41°54’ N, 1°43’, E), Cardona, Barcelona, Espanya (Objectiu 2) i Mejoramiento Porcino S.L. (10°05’ N, 84°06’, W), San José de la Montaña, Costa Rica (Objectiu 3).
Gos (Canis familiaris), de diverses races: Reprovalcan and Clínica Veterinaria Sangüeso (39°29’ N, 0°22’, W), València, Espanya (Objectiu 6).
Caiman (Caiman crocodilus fuscus): Scientific Ecotourism Project (EcoTEC), at the School of Agronomy, at Costa Rica Institute of Technology (10°21’ N, 84°30’, W), San Carlos Campus, Alajuela, Costa Rica (Objectiu 7).
Recollida i processament de les mostres En el cas dels experiments amb semen de bou, les mostres es van obtindré amb l’ús d’una vagina artificial en les condicions habituals per a la recollida amb finalitat d’elaboració de dosis seminals comercials. El volum inicial, entre 5 i 10 mL, es va mesurar amb un tub cònic graduat (0.1 mL) i la mobilitat global es determinà ficant 20 µL de semen fresc en un portaobjectes pre-escalfat a 37ºC. Les mostres es diluïren a una concentració final de 100x106, preparant-se les corresponents palletes per a la seua congelació. Per tal d’assegurar, en la mesura del possible, la formació de sub-mostres representatives i evitar imprecisions, les mostres s’homogeneïtzaren sensiblement i es distribuïren en palletes de 0.25 mL, utilitzant una màquina automàtica d’emplenament i segellat i foren immediatament congelades emprant un congelador programable amb una corba de refredament: 4°C a -10°C a -5°C/min; -10°C a -100°C a -40°C/min; -110°C a -140°C a -20°C/min i, llavors, immersió en nitrogen líquid. De cada mostra es descongelaren en un bany d’aigua a 37ºC durant 30s, buidant-se el contingut de les palletes en un tub eppendorf a la mateixa temperatura.
En els experiments realitzats en porc en Costa Rica les mostres s’obtingueren a primera hora del matí, una vegada a la setmana, utilitzant el mètode “gloved-hand” i s’introduïren immediatament en un bany a 38ºC. Es consideraren les fraccions riques en espermatozoides, diluïdes en el medi Androstar Plus®. En aquells fets a València, s’utilitzaren dosis seminals comercials de l’empresa Semen Cardona que es transportaren fins el laboratori a 17ºC, tal i com son distribuïdes a les granges de mares. Una vegada en el laboratori, les mostres s’homogeneïtzaren intensament, agafant-se 1mL que es diposità en un tub eppendorf i es mantingueren a 37ºC durant 30 min abans del seu ús.
Pel que fa al treballs amb diverses races de gos les mostres s’obtingueren per estimulació manual, dipositant-se l’ejaculat en vasos de recollida estèrils. Les mostres es diluïren a una concentració final <50 x 106 espermatozoides/mL amb el medi CaniPlus Chill abans del seu anàlisi. Les races considerades foren: Staffordshire Bull Terrier, Labrador Retriever, Mastí Español, Ratoner Valencià Dog, Buldog Anglés i Chihuahua.
Finalment, en el cas del caiman la col·lecció seminal es realitzà sense anestèsia, rere immobilització de l’animal i per estimulació manual durant l’època reproductiva natural (febrer-Juny). L’ejaculat (de poc volum) es recollí en un tub eppendorf i es diluí per a la seua estabilització amb medi DPBS.
Anàlisi de les variables espermàtiques En tots els casos s’utilitzaren sistemes CASA de la marca ISASv1®, encara que en diferents condicions de hardware i software, com s’especifica més endavant.
Els paràmetres obtinguts amb el sistema CASA-Mot foren: velocitat lineal (VSL), velocitat curvilínia (VCL), velocitat mitja ponderada (VAP), amplitud del desplaçament lateral del cap (ALH) i freqüència de batuda de la cua (BCF), així com els índex de mobilitat (LIN, STR i WOB). Endemés, quan es considerà rellevant, es valorà la mobilitat total i la mobilitat progressiva.
Pel que fa a les mesures morfomètriques, les cèl·lules es seleccionaren aleatòriament, evitant aquelles sobreposades a altres cèl·lules o a detritus del fons. S’analitzaren els següents paràmetres del cap de l’espermatozoide: àrea, perímetre, longitud, amplària, àrea corresponent a l’acrosoma (en aquelles espècies on es fa visible), elongació, el·lipticitat, rugositat i regularitat. Endemés, en algunes espècies es varen incloure les següents mesures de la peça intermitja: àrea, amplària, distància i angle de la inserció.
En el primer treball en bou, que versà en morfometria, s’utilitzà un microscopi Olympus BH-2 amb un objectiu de camp clar de 100x i un foto ocular de 3.3x, acoblat a una càmera digital Basler A312 de 768x576x8 bits amb 256 nivells de gris i una resolució, tant horitzontal com vertical de 0,08 µm/píxel. En el segon treball en aquesta espècie, ara sobre mobilitat, el microscopi utilitzat va ser un Nikon Eclipse E600 amb una platina termostatizdada a 37ºC i un objectiu de contrast de fase negatiu de 10x i una càmera digital de vídeo Proiser 782M amb una resolució en els dos eixos de 0.84 µm/píxel. El “setting” utilitzat amb el sistema CASA-Mot ISAS®v1 va capturar a una freqüència de 30 imatges per segon, amb una grandària de partícula de 14-80 µm2 i una connectivitat de 14 µm. S’avaluà l’efecte de l’ús de tres càmeres de recompte (Leja®, CellVu®, Makler®) i dos medis de dilució, Andromed® i Biladyl®.
Als dos estudis amb mostres de porc, s’utilitzaren càmeres de recompte d’un sol ús ISAS®D4C20, prèviament escalfades a 37ºC, que es carregaren per capil·laritat amb 3 µL de mostra. El microscopi utilitzat fou el UOP/Proiser UB203, calefactat a 37ºC i amb una vídeo-càmera Proiser 782M amb una resolució de 0.84 µm/píxel.
Aquesta mateixa configuració es va utilitzar en el cas del treball realitzat en caiman.
A l’últim, en el cas del treball amb races de gos, les mostres es van mantindre al llarg dels experiments a una temperatura de 24ºC i, utilitzant en mateix hardware abans esmentat, es van realitzar les captures a una freqüència de 25 imatges per segon.
Anàlisi estadística Les dades obtingudes dels diferents experiments es testaren, en primer lloc, per a la seua normalitat i homoscedasticitat utilitzant els test de Shapiro-Wilks i Levene, respectivament. Així mateix, es va realitzar els corresponents gràfics de distribució per a la seua valoració visual. Quan no es va observar la normalitat, es va realitzar la transformació de l’arrel quadrat de l’arcsinus abans de la realització dels corresponents estudis d’ANOVA de mesures repetides. Quan es mostraren diferències significatives, el test a posterior per tal de definir les possibles diferències entre grups va ser el de Bonferroni.
Quan les variables, fins i tot després de la seua transformació, no seguiren una distribució normal, es va procedir a la realització de tests no paramètrics, el Kruskal-Wallis en una primera etapa i, en cas d’observar diferències, el Test-U de Mann-Whitnay per a comprar entre els diferents grups experimentals.
Per a tots els tests, les diferències amb una P<0.05 es consideraren com a estadísticament significatives.
L’anàlisi discriminant s’utilitzà en el treball de gos per tal d’avaluar el poder predictiu de classificació de les diferents races en funció dels paràmetres cinemàtics corresponents. L’execució de l’anàlisi discriminant canònic generà una sèrie de funcions ortogonals de forma que la implicació de cada raça en la variable canònica fora el més diferent possible per la maximització de la variància inter-classe al mateix temps que minimitzava la variància intra-classe.
En referència als procediments de clústers, es realitzaren per tal de determinar la presència de subpoblacions espermàtiques a partir dels conjunts de dades tant de cinemàtica com de morfometria. Totes les dades s’estandarditzaren de forma prèvia per tal d’evitar la possible influència d’escala. L’anàlisi de clústers es va efectuar en dues etapes, sent la primera la corresponent a la realització de l’anàlisi de component principals (CP), de forma que cada CP es va contrapesar amb les seues variàncies, conegudes com a “eigenvectors”. La valoració final va considerar el nombre menor de CPs que retingueren el màxim possible de la variància original. Aquestes CPs foren utilitzades en la segona etapa de l’anàlisi, que es definiren tot seguint el criteri de Kaiser i emprant per a la definició final la rotació del mètode varimax amb la normalització de Kaiser. La segona etapa va seguir l’anàlisi no jeràrquica pel mètode de k-means i utilitzant les distàncies d’Euclides a partir de les variables quantitatives rere l’estandardització de les mateixes dades, de forma que els centres dels clústers foren els valors mitjans de les observacions assignades a cada clúster. En aquesta darrera etapa, per tal de determinar el nombre òptim de clústers, els centroides finals se clusteritzaren jeràrquicament emprant el mètode de Ward. A continuació s’aplicaren els test D’ANOVA i de 2 per avaluar les diferències en les distribucions de les observacions (espermatozoides individuals) en les diferents etapes i subpoblacions (percentatges d’espermatozoides assignats a cada subpoblació). A continuació s’aplicà el model lineal generalitzat (GLM) per determinar els efectes de les etapes, així com la seua variació, sobre la distribució relativa de freqüències dels espermatozoides en l’interior de les subpoblacions. Aquest darrer procediment se utilitzà també per tal d’avaluar la influència dels paràmetres cinemàtics o morfomètrics en la definició de les diferents subpoblacions. Les diferències entre valors mitjans entre subpoblacions s’analitzaren pel tes de Bonferroni.
Els resultats s’expressaren com a la mitja l’error estàndard de la mitja (SEM) i la significació es considerà a partir de P<0.05. totes les dades s’analitzaren utilitzant el software InfoStat (v. 2008) per a Windows, paquet IBM SPSS, versió 23.0.
Resultats i valoració En el primer treball (capítol IV), l’aproximació “clàssica”, basada en l’ANOVA, va mostrar-se insuficient per a la correcta definició de la realitat present en la població total d’espermatozoides, no convenientment representada per tendències centrals, encara que va posar de manifest diferències entre animals, ejaculats i palletes. L’anàlisi de CP mostrà que el conjunt de les variables morfomètriques analitzades s’agruparen en una CP relativa a la grandària una segona CP relacionada amb la forma del cap de l’espermatozoide. L’anàlisi subpoblacional evidencià la presència de quatre subpoblacions referides a caps grans, xicotets, curts i estrets que representaren el 31, 27,24 i 18%del total de la població, respectivament. La distribució de subpoblacions va ser diferent entre animals i ejaculats, encara que no sempre entre palletes. Aquesta nova aproximació que considera al conjunt dels espermatozoides de una mostra dividit en diferents subpoblacions funcionals en funció de paràmetres quantificables generats per sistemes CASA-Morph obre una nova visió de la funció espermàtica.
En el segon treball, en porc (capítol V), es va posar de manifest que la freqüència de captura d’imatges va afectar sensiblement els paràmetres cinemàtics, sent la VCL la variable més sensible. Tots els paràmetres mostraren diferències entre animals. L’estudi de correlació no lineal va mostrar una corba asimptòtica amb un punt de saturació per a la VCL de 212 imatges per segon, mostrant-se com el paràmetre més sensible. En referència a la valoració de la mobilitat total i la progressiva 50 i 100 imatges per segon foren suficients, respectivament. L’anàlisi de components principals va oferir tres CPs (velocitat, progressivitat i oscil·lació), que es mostraren independents de la freqüència de captura utilitzada. Finalment, les cèl·lules s’agruparen en quatre subpoblacions que si variaren, tant en la seua cinètica com en la seua distribució, segons la freqüència de captura. Fins al present les càmeres de vídeo presentaven limitacions en la capacitat de incrementar la freqüència de captura el que ha tingut un efecte negatiu en la validesa dels resultats.
En el tercer treball (capítol VI), es va observar, en mostres de porc, que tant la mobilitat total com la progressiva no es veien afectades per la duració del vídeo analitzat, mentre que tenia un efecte significatiu tant respecte de les velocitats com dels índex, però no en l’ALH o la BCF. Tots els paràmetres mostraren diferències entre animals. Els resultats demostraren doncs que la valoració de la cinètica espermàtica es veu afectada pel temps d’anàlisi el que es va posar de manifest amb l’anàlisi de clústers que va mostrar el fet que una durada curta de la gravació pot sobreestimar el percentatge de cèl·lules ràpides no-progressives. Així doncs, es recomana analitzar al menys mig segon per a l’avaluació de la mobilitat i dos segons per a la cinètica.
En el quart treball (capítol VII) posarem de manifest que l’acrònim CASA (Computer Assisted Semen Analysis) per sí mateix resulta insuficient, donat que l’anàlisi pot referir-se a diferents aspectes de la funcionalitat espermàtica, com ara la concentració, mobilitat/cinètica, morfologia/mofometría, Fragmentació del DNA... o combinacions dels mateixos. Com a conseqüència proposarem una nova terminologia, basada en l’ús del terme CASA per a referir-nos-en a la tecnologia, seguit de l’abreviació corresponent que indique l’aspecte estudiat, com ara CASA-Conc (per a concentració), CASA-Mot (per a la mobilitat, tot incloent-hi la cinètica) o CASA-Morph (per a la morfologia i morfometria).
En el cinquè treball (capítol VIII) s’avaluà l’efecte del tipus de càmera i del medi de dilució en la valoració cinemàtica de mostres descongelades de bou. En les càmeres emplenades per capil·laritat (Leja i CellVu) s’analitzaren nou posicions, considerant les àrees central i lateral (sumant els dos laterals), així com l’eix longitudinal. En el cas de la càmera Makler (de forma circular) s’analitzaren també nou camps però no es va poder establir una variació direccional. Independentment del medi de dilució (Biladyl o Andromed), hi hagué variacions en les característiques de mobilitat entre les diferents càmeres, indicant que l’eix longitudinal introdueix variacions en els valors obtinguts. Així mateix va haver un efecte del medi de cultiu. Aquests resultats indiquen la necessitat de realitzar un mostreig representatiu (cosa infreqüent fins al present) i definir protocols adients a cada espècie i condició per al correcte ús de la tecnologia CASA-Mot.
El sisè treball (capítol IX) va evidenciar que els paràmetres cinemàtics estudiats mostrares diferències entre les diverses races de gos. Els espermatozoides amb major velocitat foren els corresponents als Stafforshire Bull Terriers i els de menor al Chihuahua. El coeficient de variació intra-mascle fou major que el inter-mascle per a totes les races, sent el Stafforshire Bull Terrier el que mostrà els valors menors. L’anàlisi discriminant mostrà una elevada capacitat de predicció de la raça a la que pertanyien els espermatozoides. L’anàlisi de clústers mostrà una classificació jeràrquica prou coincident a la referida a filogènies basades en marcadors genètics. Futurs treballs sobre espermatozoides de gos hauran de tindre present les diferències entre races, de forma que els resultat no poden ser transferits d’una a l’altra. Els resultats obtinguts indiquen que el gos potser considerat un bon model en biologia evolutiva per a examinar canvis en diversos paràmetres reproductius associats a processos de selecció.
Finalment, en el setè treball (capítol X), relatiu a mostres de semen de Caiman crocodilus fuscus, tant la mobilitat total i progressiva es mostraren constant entre diferents individus, però si hagué diferències significatives respecte dels paràmetres de morfometria i cinètica (tant velocitats com índex). L’anàlisi de CPs va agrupar les variables en quatre components, relatives a la progressivitat, la velocitat, l’oscil·lació i la grandària del cap de l’espermatozoide. Es van obtindre quatre subpoblacions corresponents a les cèl·lules xicotetes de velocitat mitjana i no progressiva, grandària mitja lents no progressius, grans mitjos progressius i xicotets ràpids progressius. La distribució de subpoblacions varià entre animals el que pot presentar relacions ambla fertilitat.
Conclusions La present Tesi Doctoral ha analitzat l’aplicació de la tecnologia CASA i de l’anàlisi estadística multivariant per tal d’optimitzar l’avaluació seminal en espècies domèstiques i salvatges. Les conclusions a que s’ha arribat són: 1. Si més no en el cas del boví, les aproximacions tradicionals per a l’estudi de la morfometria espermàtica, basades en l’ANOVA, no son suficientment satisfactòries per definir les subpoblacions espermàtiques, el que fa necessari l’ús de l’estadística multivariant basada en l’anàlisi de components principals. Les diferències observades en l’estructura subpoblacional de diferents palletes del mateix animal posen en dubte l’anterior idea que la susdita estructura era característica de cada animal, el que indica que també pot estar relacionada amb respostes fisiològiques en resposta al medi ambient.
2. Assumint la BCF i la VCL com els paràmetres més sensitius a la modificació de la freqüència de captura, es recomana capturar el més proper a 225 imatges per segon per a l’avaluació cinemàtica del semen de porc. Per contra, si l’objectiu és mesurar la mobilitat total 50 imatges per segon són suficients i en el cas de la mobilitat progressiva caldrien 150. Qualsevol treball futur ha de tindre present aquest resultats tant en els camps de la recerca com de la producció.
3. Es recomana capturar seqüències de dos segons per a l’estudi cinètic de mostres de porc, sent suficient l’anàlisi de mig segon per avaluar les mobilitats total i progressiva.
4. Suggerim la següent terminologia per tal d’evitar confusions respecte de la tecnologia CASA: l’ús genèric del terme CASA per referir-se a la tecnologia en sí mateixa, que es seguirà de l’abreviatura que indique l’anàlisi específic a que cada sistema es refereix. Per exemple CASA-Mot (per a la mobilitat, incloent-hi la cinètica) i CASA-Morph (per a la morfologia, incloent-hi la morfometria), que són els dos sistemes utilitzats en la present Tesi Doctoral.
5. Si més no, en el cas del boví, l’ús de diferents càmeres de recompte i de medis de dilució causen canvis significatius en l’estimació de la cinètica espermàtica. Així mateix és necessari tindre en compte l’àrea de recompte dins la càmera perquè hi ha diferències, particularment respecte de l’eix de desplaçament vertical.
6. En base a les diferències significatives observades en les característiques cinemàtiques entre diferents races de gos posa en evidència l’error que ha suposat la repetida generalització del concepte “gos”, barrejant races incontroladament. Les races de gos poden constituir un model molt útil per examinar la diversitat de respostes en estudis reproductius així com per a la millor comprensió de diversos aspectes de la biologia reproductiva de la femella que podrien estar influenciats per l’evolució de les característiques espermàtiques.
7. L’avaluació de la qualitat seminal resulta molt important en els programes de conservació d’espècies, com hem posat de manifest en el cas del caiman. Els resultats obtinguts en la present Tesi Doctoral poden contribuir al desenvolupament de protocols fiables respecte de l’anàlisi seminal d’espècies de rèptils que poden ser usats per a la determinació del seu potencial reproductiu. L’avaluació espermàtica basada en tecnologia CASA pot facilitar estudis de fisiologia espermàtica i de preservació d’aquestes espècies.
