Modificaciones fenotípicas de las células mesenquimales procedentes de la gelatina de Wharton como base para su utilización en ingeniería tisular vascular
Authors
Pérez Köhler, BárbaraDate
2012Keywords
Injertos vasculares
Histología
Description / Notes
Premio Extraordinario de Doctorado de la UAH en 2013
Premio de la Sociedad de Condueños 2013
Document type
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Version
info:eu-repo/semantics/acceptedVersion
Access rights
info:eu-repo/semantics/openAccess
Abstract
La gelatina de Wharton del cordón umbilical contiene una población de células de aspecto mesenquimatoso, denominadas células de la gelatina de Wharton (WJC). Las WJC aisladas y expandidas en cultivo presentan características que las permiten ser clasificadas como células madre mesenquimales: morfología elongada, crecimiento adherente, capacidad proliferativa, expresión positiva para marcadores relacionados con el fenotipo mesenquimal, y potencial de diferenciación multilinaje. Las WJC podrían emplearse en diversas aplicaciones de Ingeniería Tisular, por ejemplo en el diseño de equivalentes tisulares destinados a la reparación arterial. Para diseñar el sustituto vascular "ideal" es necesario combinar elementos que permitan elaborar un constructo cuyas propiedades físicas y mecánicas sean similares a las presentes en el vaso nativo: soporte estructural (biomateriales de origen biológico o sintético), células (autólogas o heterólogas) y señales (factores de crecimiento, moléculas de adhesión, estímulos mecánicos, etc.). Un constructo vascular diseñado con estos componentes podría permitir la integración tisular en la arteria receptora, así como intervenir en el proceso cicatrizal de hiperplasia intimal desencadenado tras la realización del injerto. Los biomateriales de politetrafluoroetileno expandido (ePTFE) son uno de los modelos protésicos más utilizados en cirugía vascular. A pesar de su buen rendimiento, en ocasiones estos injertos fracasan a causa de procesos de trombosis y reestenosis. El recubrimiento de la superficie luminal del ePTFE con una siembra de células endoteliales podría incrementar la eficacia del constructo vascular. Sin embargo, el uso de estas células está condicionado a la disponibilidad de una fuente de obtención celular adecuada, lo que genera la necesidad de localizar otra estirpe candidata que pueda emplearse como alternativa a la utilización de las células endoteliales. Las hipótesis planteadas en esta Tesis Doctoral pretenden dilucidar si las WJC constituyen una población mesenquimal capaz de diferenciarse hacia la línea endotelial, y si estas células pueden colaborar en mejorar la permeabilidad de prótesis vasculares de ePTFE de pequeño calibre (diámetro interno de 4 mm). Para ello, desarrollamos dos objetivos basados en modelos experimentales in vitro e in vivo, respectivamente: 1.En el primer objetivo, aislamos células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) y WJC, cultivando las HUVEC con medio M199 (medio enriquecido con factor de crecimiento de células endoteliales) y las WJC con AmnioMAXTM-C100 (medio idóneo para el cultivo de células de tipo indiferenciado). Seleccionamos los subcultivos primero, tercero y quinto para llevar a cabo los diferentes análisis morfológicos y fenotípicos (inmunofluorescencia, citometría de flujo, MET), así como los estudios de viabilidad (Azul Tripán, AlamarBlue®), proliferación (RTCA), síntesis de sustancias (ELISA), y expresión génica (qRT-PCR). Sometimos diversos cultivos de WJC a un estímulo de diferenciación endotelial, mediante el cultivo con medio M199. Estudiamos las modificaciones fenotípicas de esta nueva población diferenciada (Dif-WJC), comparando los resultados con los observados en la estirpe indiferenciada WJC y en HUVEC. 2.En el segundo objetivo, diseñamos una serie de constructos vasculares utilizando biomateriales tubulares de ePTFE (4 mm de diámetro interno y 30 [my]m de distancia internodal), en cuya superficie luminal (pretratada con fibronectina 20 [my]g/mL) sembramos las distintas estirpes celulares, estableciendo cuatro grupos de estudio: ePTFE control (sin siembra celular), ePTFE + HUVEC, ePTFE + WJC y ePTFE + Dif-WJC. Evaluamos la eficacia de la siembra celular bajo condiciones de cultivo estáticas (24 h, 48 h, 7 d) y dinámicas (1 h), al someter los constructos a un circuito de flujo pulsátil. Utilizamos los constructos de los diferentes grupos experimentales en un modelo de sustitución arterial en la arteria femoral común de perros de raza Beagle (n=8), durante periodo de estudio de 60 días, tiempo tras el cual llevamos a cabo análisis morfológicos (MEB), morfométricos (mediciones) e histológicos (tinciones, inmunohistoquímica) con el fin de evaluar los procesos de reparación arterial. Los resultados del primer objetivo revelaron que las HUVEC constituyen una población endotelial muy diferenciada, con una intensa expresión génica y proteica de marcadores clave de la línea endotelial (CD31, CD34, vWF). Aunque estas células no producen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interaccionan con él a través de los receptores Flt-1 y KDR (receptores VEGFR-1 y VEGFR-2, respectivamente). Estas células tienen un potencial proliferativo limitado, debido a su estadío de maduración, y una gran capacidad de síntesis y liberación de un intermediario de la prostaciclina (6-keto-prostaglandina-F1[alfa]), la cual disminuye gradualmente entre el primer y el quinto subcultivo. Las WJC tienen características fenotípicas a medio camino entre la célula fibroblástica y la miofibroblástica, su aspecto es aspecto fusiforme y presentan un citoesqueleto con filamentos de [alfa]-actina de músculo liso y desmina. Tienen expresión génica positiva para los factores de transcripción Nanog y Oct-4. Son células de tipo mesenquimal no hematopoyéticas con inmunofenotipo positivo para CD105, CD146 y CD90, con la particularidad de que el porcentaje de expresión de CD105 y CD146 disminuye gradualmente a medida que avanzan los subcultivos, tornándose negativas en el quinto subcultivo. Son células productoras de VEGF, con un mecanismo de retroalimentación positiva regulado, aparentemente, por el receptor Flt-1. Las Dif-WJC, al ser cultivadas en un medio de diferenciación endotelial, experimentan una serie de modificaciones fenotípicas relevantes: pierden el aspecto fusiforme tornándose poligonales, incrementan la presencia de filamentos de desmina, aumentan su volumen citoplasmático, y reducen su capacidad proliferativa, manteniendo lo niveles de viabilidad celular semejantes a los de WJC. La expresión de Nanog y Oct-4 se reduce ligeramente en comparación con las células indiferenciadas. A pesar del estímulo exógeno de diferenciación endotelial, estas células no muestran expresión de CD31, CD34, vWF, ni liberan al medio de cultivo 6-keto-prostaglandina-F1?. Los resultados del segundo objetivo revelaron que la efectividad de la siembra celular es muy semejante en todos los grupos experimentales: las células forman una capa que tapiza el lumen protésico a las 24 h, se mantiene estable a las 48 h, y presenta evidentes signos de degeneración tras 7 días de cultivo. Cuando los constructos se someten a circuito de flujo pulsátil durante 1 h, éste provoca la denudación del 70-80% de la superficie protésica en todos los grupos, demostrando la gran influencia de las fuerzas de cizallamiento del flujo sobre la estabilidad de la capa celular sembrada en el biomaterial. El análisis morfológico e histológico llevado a cabo a los 60 días post-implante reveló que los constructos de ePTFE sin siembra celular (grupo control) tienen el mayor índice de fracaso (75% de oclusión), y una hiperplasia intimal superior a la de los demás grupos experimentales. Los constructos sembrados con HUVEC presentan la mejor permeabilidad (25% de oclusión) y una hiperplasia intimal significativamente menor que la del grupo control. El comportamiento de los grupos sembrados con WJC y Dif-WJC mejora lo observado en el grupo control (55% y 50% de oclusión, respectivamente), aunque su permeabilidad no alcanza la del grupo sembrado con HUVEC. El grupo sembrado con Dif-WJC es el que presenta la menor hiperplasia intimal, con un espesor más o menos homogéneo entre los extremos proximal y distal. Todos los grupos experimentales presentan: moderada infiltración celular en el interior del ePTFE, leve reacción macrofágica, y formación de una capa neoadventicial con células de aspecto fibroblastoide, microvasculatura y abundante cantidad de colágeno de tipo I. En conjunto, estos resultados nos han permitido rechazar nuestra primera hipótesis afirmando que, bajo las condiciones experimentales diseñadas, las células de la gelatina de Wharton constituyen una población celular de tipo mesenquimal determinada hacia la línea conjuntiva, y no sensible a un medio de diferenciación endotelial. Por el contrario, hemos podido elevar nuestra segunda hipótesis a la categoría de Tesis, afirmando que las células mesenquimales diferenciadas de la gelatina de Wharton favorecen la formación de una capa neointimal de menor espesor y de características más estables que las otras estirpes celulares estudiadas, lo que podría permitir a estas células colaborar en la reducción de los procesos de reestenosis desencadenados en la prótesis vascular.
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