Estudios estructurales y funcionales de la DNA polimerasa y la proteína terminal del bacteriófago φ29
Author
Prado Díaz, Alicia delEntity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2015-01-23Subjects
ADN polimerasas - Tesis doctorales; Bacteriófagos - Genética - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 23-01-2015Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El fago φ29 tiene un genoma lineal de DNA de doble cadena con una proteína terminal
(TP) unida covalentemente a los extremos 5’ (TP-DNA) que junto con una secuencia específica
constituye los orígenes de replicación. Para iniciar la replicación, la DNA polimerasa forma un
heterodímero con una TP libre y reconoce el origen de replicación usando como iniciador el
grupo hidroxilo de la Ser232 de la TP.
La resolución de la estructura cristalográfica del heterodímero DNA polimerasa/TP de
φ29, ha permitido la identificación de residuos de la TP que podrían ser responsables de la
interacción con la DNA polimerasa. Ensayos realizados mediante análisis in vitro de mutantes
puntuales en dichos residuos, mostraron que su sustitución tiene efecto tanto en la estabilidad
del complejo TP/DNA polimerasa (R158A) como en la interacción funcional de la TP en el
centro activo de polimerización de la DNA polimerasa (R169A, E191A, Y250A, E252A,
Q253A y R256A), afectando a los primeros pasos de la replicación y permitiéndonos proponer
un papel de estos residuos en el mantenimiento del equilibrio entre la estabilización del dominio
iniciador de la TP y su salida gradual del centro activo de polimerización de la DNA polimerasa
a medida que el nuevo DNA está siendo sintetizado.
Los ensayos realizados en esta Tesis con mutantes en la Lys529 de la DNA polimerasa
de φ29 mostraron su papel en garantizar la estabilización de la cadena iniciadora en el centro
activo de polimerización, y como consecuencia, en la inserción del nucleótido entrante. La
Lys529 también es crítica en el paso de translocación requerido para la incorporación del
siguiente nucleótido. Además, podría estar regulando la actividad exonucleasa de la DNA
polimerasa, actuando como una barrera para prevenir el exceso de degradación del sustrato.
Ensayos realizados combinando estos mutantes de la DNA polimerasa con mutantes en el
residuo Glu233 de la TP nos permiten proponer que se requiere un contacto directo entre la
Lys529 y el Glu233 para la iniciación de la replicación del TP-DNA y su posterior
translocación para completar la replicación del genoma.
La iniciación de la replicación del DNA de φ29 ocurre frente al segundo nucleótido en 3’
de la cadena molde. Estudios previos mostraron que el dominio iniciador de la TP es el
responsable de dictar la posición del molde usada para dirigir la reacción de iniciación. Los
resultados obtenidos utilizando quimeras en las que se intercambiaron las hélices del dominio
iniciador de la TP de φ29 con las correspondientes al fago relacionado Nf, así como mutantes de
la TP del priming-loop de los fagos φ29 y Nf en los que se modificó la posición del residuo
aromático, mostraron que el principal determinante estructural para dirigir el nucleótido interno
en 3’ usado como molde en la reacción de iniciación en φ29 es el residuo aromático Phe230 del
priming-loop. Bacteriophage φ29 genome consists of a linear double-stranded DNA with a terminal
protein (TP) covalently linked to each 5’ end (TP-DNA) that together with a specific sequence
constitutes the replication origins. To initiate replication, the DNA polymerase forms, with a
free TP, a heterodimer that recognizes the origins and initiates replication using as primer the
hydroxyl group of TP residue Ser232.
The 3D structure of the DNA polymerase/ TP heterodimer allowed the identification of
TP residues as potential DNA polymerase ligands. In this work we have studied the role of
these TP residues by in vitro analyses of their mutant derivatives. The results showed that
substitution of these residues had an effect on either the stability of the TP/DNA polymerase
complex (R158A) or in the functional interaction of the TP at the polymerization active site
(R169A, E191A, Y250A, E252A, Q253A and R256A), affecting the first steps of φ29 TP-DNA
replication. Therefore, these TP residues are playing a role in the maintenance of the
equilibrium between the TP-priming domain stabilization and its gradual exit from the
polymerization active site of the DNA polymerase as the new DNA is being synthesized.
In this Thesis we have made site-directed mutants at Lys529 of the DNA polymerase of
φ29 to analyse its functional importance for the synthetic activities of φ29 DNA polymerase.
Residue Lys529 is important in guaranteeing the stabilization of the primer-terminus at the
polymerization active site, and as a consequence, in the insertion of the incoming nucleotide. Its
role is also critical in the translocation step required for the next incoming nucleotide
incorporation. On the other hand, Lys529 could regulate the exonuclease activity of the DNA
polymerase, acting as a barrier to prevent overdegradation of the substrate. In addition,
combination of the DNA polymerase mutants with a TP derivative at residue Glu233 leads us to
infer that a direct contact between Lys529 and Glu233 is required for the initiation of TP-DNA
replication and further translocation to allow complete genome replication.
The initiation of φ29 DNA replication mainly occurs opposite the second nucleotide at
the 3’ end of the template. Previous studies showed that the TP priming domain dictates the
template position used to direct the initiation reaction. The results obtained using chimerical
TPs made by interchanging individual α helixes of the TP priming domain of the related phages
φ29 and Nf, as well as φ29 mutant TPs at the priming-loop residues, indicated that the aromatic
residue Phe230 of the priming-loop is the main structural determinant to direct the internal 3’
nucleotide used as template in the initiation reaction.
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