Caracterización de los genes AtbZIP53 de arabidopsis thaliana y HvbZIP53 de cebada y su participación en la regulación génica durante el desarrollo de la semilla

Resumen

ABSTRACT

In Plants, bZIP transcription factors regulate a wide range of plant processes. In general bZIP proteins bind DNA as dimers which occur in a specific manner. The expression of many seed storage protein genes in cereals relies on transcription factors of the bZIP class, belonging to the maize OPAQUE2 family (C-group in Arabidopsis). Barley BLZ1 and BLZ2, and Arabidopsis AtbZIP10 and AtbZIP25, are implicated in the regulation of gene expression during seed maturation. The aim of this work was the identification of other bZIP factors implicated in gene regulation during seed maturation by heterodimerization with the bZIP mentioned above. Based on the specific heterodimerization between proteins of the groups C and S1, AtbZIP53 (a member of the later) was identified as a possible candidate implicated in seed gene regulation. The transcriptome analysis of AtbZIP53-overexpressing seedlings showed the induction of seed specific genes. We determined that AtbZIP53 is expressed in the embryo during the maturation of Arabidopsis seeds. AtbZIP53 is able to form heterodimers with AtbZIP10 and AtbZIP25. The formation of these heterodimers is necessary for the activation of the promoters of Albumine 2S2 and Cruciferin genes in transient expression assays. In addition, it was determined that although these factors bind to DNA as homodimers, the affinity of the heterodimers is greater. The synergistic action of AtbZIP10, AtbZIP25 and ABI3 has been described in the regulation of the storage protein genes. ABI3 is also able to interact with the heterodimers AtbZIP53/AtbZIP10-25 and this interaction enhances the transactivation properties of such heterodimers. In order to identify new bZIP proteins implicated in the regulation of gene expression during seed development in barley, we searched for the AtbZIP53 ortholog. One EST with an ORF that encondes a protein that shares 58% sequence identity with AtbZIP53 was identified. HvbZIP53 is expressed during endosperm development, and it is mainly expressed in the ESR (Embrion Sorrounding Region) and in transfer cells. When transform into Arabidopsis, HvbZIP53 induces the expression of some of the genes upregulated in AtbZIP53-overexpressing plants, which indicates that there is at least partial functional equivalence between these genes. In addition, we have determined that HvbZIP53 forms heterodimers with BLZ1 and BLZ2. The AtbZIP53/BLZ1 heterodimer regulates the expression of the Asparragine Synthetase 1 gene (HvAS1). HvBLZ1 and HvAS1 are coexpressed with HvbZIP53 in the cells of transference and region ESR in endosperm development.
In conclusion this thesis contributes to the understanding of the transcriptional regulation during the seed development and, in particular, the role of heterodimerization as an additional mechanism to modulate gene expression.

RESUMEN

Los factores transcripcionales bZIP son una familia de proteínas implicadas en la regulación de la expresión génica de una variada gama de procesos en las plantas. Su principal característica estructural es la presencia de un dominio básico capaz de unir DNA, realizándose esta unión a través de dímeros que se forman una manera específica. La expresión de muchos genes de proteínas de reserva, tanto en la semilla de cereales como de dicotiledóneas, depende de la expresión de los factores bZIP del tipo Opaco-2 de maíz (grupo C en Arabidopsis). En cebada los factores BLZ1 y BLZ2 y en Arabidopsis los factores AtbZIP10 y AtbZIP25 participan en la regulación génica durante la maduración de la semilla. En esta tesis se planteó la búsqueda de factores bZIP involucrados en la regulación génica durante la maduración de la semilla mediante la heterodimerización con las proteínas bZIP antes mencionados. Basados en la heterodimerización específica entre proteínas de los grupos C y S1, se identificó a AtbZIP53 (perteneciente a este último) como posible candidato implicado en regulación génica en semilla. El análisis del transcriptoma mediante hibridación de micromatrices de plantas que sobreexpresan AtbZIP53, permitió detectar la inducción de genes específicos de semilla. Además determinamos que AtbZIP53 se expresa en el embrión durante la maduración de la semilla de Arabidopsis. AtbZIP53 es capaz de formar heterodímeros con AtbZIP10 y con AtbZIP25. La formación de estos heterodímeros es necesaria para la activación de los promotores de los genes que codifican Albúmina 2S2 y Cruciferina en ensayos de expresión transitoria. Se determinó que si bien estos factores son capaces de unirse al DNA como homodímeros, la afinidad de los heterodímeros es mayor. Se ha descrito la acción sinérgica de AtbZIP10, AtbZIP25 y ABI3 en la regulación de los genes de proteínas reserva. ABI3 también es capaz de interaccionar con el heterodímero AtbZIP53/AtbZIP10-25 y esta interacción potencia la capacidad activadora de dicho heterodímero. Con objeto de comparar la regulación génica en semillas de dicotiledóneas (Arabidopsis thaliana) y monocotiledóneas (Hordeum vulagare L.), nos propusimos identificar el ortólogo de AtbZIP53 en cebada. Mediante una búsqueda en bases de datos, se identificó un EST que contenía un ORF que codifica una proteína posiblemente ortóloga, HvbZIP53, que presenta un 58% de identidad de sequencia con AtbZIP53. HvbZIP53 se expresa durante el desarrollo del endospermo, estando su expresión principalmente localizada en la región que rodea al embrión (ESR: Embryo Sorrounding Region) y en las células de transferencia. La expresión de HvbZIP53 en hojas de Arabidopsis induce la expresión de algunos de los genes para los que se observó un aumento de expresión en las plantas 35S:AtbZIP53, lo que indica que hay una equivalencia, al menos parcial, de funciones entres estos genes. Además, hemos determinado que HvbZIP53 forma heterodímeros con BLZ1 y con BLZ2 y que el heterodímero AtbZIP53/BLZ1 regula la expresión del gen que codifica Asparragina Sintetasa 1 (HvAS1). HvBLZ1, y HvAS1 se coexpresan con HvbZIP53 en las células de transferencia y en la región ESR en endospermo de cebada en desarrollo. En conclusión esta tesis contribuye a un mejor conocimiento de la regulación transcripcional durante el desarrollo de la semilla y en especial al papel de la heterodimerización de bZIPs como mecanismo adicional de modulación de la regulación transcripcional.