Papel del motivo LExE de las DNA polimerasas que inician con proteína terminal en la interacción con el nucleótido entrante. Estabilización de los sustratos en el centro activo de polimerización mediada por el subdominio TPR1
Entity
UAM. Departamento de Biología Molecular; Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBM)Date
2017-09-22Subjects
Bacteriófagos - Tesis doctorales; Biología y Biomedicina / BiologíaNote
Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 22-09-2017Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-03-2019
Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
El motivo LExE se encuentra conservado en todas las DNA polimerasas del tipo
eucariota, y se localiza cerca del centro activo de polimerización. Estudios previos sugieren que
el segundo Glu interacciona con el tercer ion no catalítico en la DNA polimerasa de RB69. En el
subgrupo de las DNA polimerasas que inician la replicación con proteína terminal (TP), el primer
Glu del motivo LExE está sustituido por Phe/Trp y precedido por una Gly. Se construyeron
mutantes puntuales para los residuos aminoacídicos Gly481, Trp483, Ala484 y Glu486
pertenecientes a la DNA polimerasa de ϕ29. Los resultados obtenidos junto a la resolución
cristalográfica de la estructura del complejo ternario de la DNA polimerasa de ϕ29 nos permiten
concluir que la Gly481 y el Trp483 podrían estar formando un bolsillo donde se acomoda la
cadena lateral de la Val250, orientándola correctamente para interaccionar con el dNTP entrante.
Los mutantes en el residuo Glu486 son también deficientes en polimerización y, como los
mutantes en los residuos Gly481 y Trp483, en la actividad de pirofosforolisis cuando se usa el
ion Mg2+, recuperando ambas actividades en presencia de Mn2+ e indicando un posible papel del
Glu486 en la interacción con la fracción de pirofosfato del dNTP.
La DNA polimerasa del fago ϕ29 contiene dos subdominios denominados TPR1 y TPR2
(Terminal Protein Region), específicos de las DNA polimerasas del subgrupo de Proteinpriming.
Estudios previos llevados a cabo sobre la región TPR1 de la DNA polimerasa de ϕ29
revelaron que este subdominio establece las principales interacciones con la TP, además de
contribuir a la correcta orientación tanto del extremo 3´-OH de una cadena iniciadora de DNA
como del grupo OH- de la Ser232 de la TP en el centro activo de polimerización (Dufour et al.,
2000; Dufour et al., 2003). El estudio de los residuos del subdominio TPR1 localizados en el
loop y situados en la entrada del surco de unión de los sustratos de la polimerasa, DNA y TP,
permiten concluir un papel en la unión y/o estabilización de la molécula iniciadora en el centro
activo de polimerización para el residuo Tyr310. Además, el residuo Tyr310 es importante para
la correcta estabilización de la TP iniciadora en el centro activo de polimerización de la DNA
polimerasa durante los procesos de síntesis de DNA. Así mismo, los mutantes puntuales R306A
y F309A presentan deficiencias en las reacciones de iniciación de la replicación y posterior
elongación cuando se utiliza como iniciador la proteína terminal, a pesar de cosedimentar con
esta última. Estos resultados indican que las DNA polimerasas mutantes no son capaces de situar
de manera correcta el dATP iniciador en el centro activo de polimerización, sugiriendo que los
residuos Arg306 y Phe309 contribuyen a la correcta orientación del grupo OH- de la Ser232 en la iniciación de la replicación del genoma del fago. The LExE motif is conserved in the eukaryotic-type DNA polymerases being located
close to the polymerization active site. Previous researches suggested that the second Glu was
involved in binding a third noncatalytic ion in bacteriophage RB69 DNA polymerase. In the
Protein-priming DNA polymerases subgroup, the LEXE motif lacks the first Glu in most cases,
but it has a conserved Phe/Trp and a Gly preceding it. To ascertain the role of those residues, we
have analyzed the behavior of mutants at the corresponding ϕ29 DNA polymerase residues
Gly481, Trp483, Ala484, and Glu486. We show that mutations at Gly481 and Trp483 hamper
insertion of the incoming dNTP in the presence of Mg2+ ions, a reaction highly improved when
Mn2+ was used as metal activator. These results, together with previous crystallographic
resolution of ϕ29 DNA polymerase ternary complex, allow us to infer that Gly481 and Trp483
could form a pocket that orients Val250 to interact with the incoming dNTP. Mutants at Glu486
are also defective in polymerization and, as mutants at Gly481 and Trp483, in the
pyrophosphorolytic activity with Mg2+. Recovery of both reactions with Mn2+ supports a role for
Glu486 in the interaction with the pyrophosphate moiety of the dNTP.
ϕ29 DNA polymerase contains two subdomains, named TPR1 and TPR2 (Terminal
Protein Region), specifically present in the protein-priming DNA polymerases subgroup.
Previous studies revealed an important role of the TPR1 subdomain in establishing the main
interactions with TP. It also contributes to the right orientation of both, the terminal 3’-OH group
of the primer DNA strand and the OH- group of the TP residue Ser232 at the polymerization
active site (Dufour et al., 2000; Dufour et al., 2003). In the second part of this work we have
focused on specific residues of the TPR1 subdomain loop which are localized at the entrance of
the DNA and TP binding groove. Our results allow us to conclude a role for Tyr310 in the correct
stabilization/orientation of the priming molecule at the polymerization active site during the DNA
synthesis process. Likewise, we have shown that R306A y F309A mutants exhibit defects during
initiation of replication and further elongation when using a TP as primer, despite of
cosedimenting with the latter protein. Altogether, the results indicate that the mutant DNA
polymerases are unable to place correctly the initiator dATP molecule at the polymerization
active site, suggesting that residues Arg306 y Phe309 contribute to the correct orientation of the OH- group of TP Ser232 during the initiation of phage genome replication.
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Texto de la Tesis Doctoral
Google Scholar:Santos del Río, María Eugenia
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