Rev Méd Chile 2003; 131: 359-365

 

Mutación puntual del gen supresor de tumores TP53 en lesiones preneoplásicas y neoplásicas del estómago Juan Carlos Araya O, Juan Carlos Roa S, Miguel Angel Villaseca H, Iván Roa E, Pablo Guzmán G, César Alvarado Ca, Angélica Melo Ab. Mutations of TP53 suppressor gene in pre-neoplastic and neoplastic lesions of the stomach: cross- sectional study in a high risk region

 

 

 

 

 

 

 

 

Background: In the current model for the development of gastric cancer, regions of multifocal atrophic gastritis give rise to intestinal metaplasia, dysplasia and finally, adenocarcinoma. Aim: To study the frequency and characteristics of TP53 gene mutations in preneoplastic and neoplastic lesions of the stomach. Material and methods: DNA sequencing of the TP53 gene was performed in 46 patients with gastric carcinoma. Normal mucosa, intestinal metaplasia and invasive adenocarcinoma tissues were obtained by scraping 6-µm histological sections from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue. Results: DNA sequencing of exons 5-9 of the TP53 gene demonstrated a mutation in 31% of patients. These findings were seen both in tumoral tissue (13 cases) and in intestinal metaplasia (2 cases). Most mutations were found in exons 5 and 8, and the majority of them were transitions (10 out of 19 mutations). Discussion: Patients with gastric cancer showed a frequency of TP53 mutations similar to that previously communicated in populations with low gastric cancer risk. Moreover, there was a predominance of transitions, genetic alterations that are identified with carcinogenesis associated with N-nitrosamine compounds. Finally, mutations of TP53 gene were detected in areas of intestinal metaplasia (Rev Méd Chile 2003; 131: 359-65).

(Key Words: Adenocarcinoma; Genes, supressor, tumor; Metaplasia)

Recibido el 7 de octubre, 2002. Aceptado en versión corregida el 11 de marzo, 2003.
Trabajo parcialmente financiado por FONDECYT 1970371 y 1970874.
Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera,
Temuco, Chile. ^aAlumno de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera.
^bTecnólogo Médico.

Desde un punto de vista biológico, la génesis y la progresión del carcinoma gástrico de tipo intestinal se caracterizan por la aparición de mutaciones y alteraciones genéticas que ocurren durante un largo tiempo^1-3. Desde un punto de vista histológico la lesión inicial sería la llamada gastritis atrófica multifocal (GAM)⁴, la cual es seguida por metaplasia intestinal y, eventualmente, displasia gástrica⁵. Después de un período de 30 a 50 años algunos pocos individuos portadores de GAM desarrollan mutaciones sucesivas que proporcionarían una ventaja proliferativa⁶, expansión clonal⁷ y, finalmente, desarrollo tumoral⁸.

El cáncer gástrico presenta frecuentes inactivaciones de múltiples genes supresores de tumores, incluyendo a los genes TP53, APC y DCC^9,10. Tal inactivación se produciría por pérdida de la heterozigosidad, inestabilidad microsatelital o por mutación puntual. El gen TP53 presenta tales lesiones entre 20 y 60% de los casos estudiados^3,11-14, lo cual varía de acuerdo al tamaño de la muestra y el método empleado para su detección^9,10,15. Por otro lado, el momento en que ocurre cada una de estas lesiones en la cascada carcinogenética aún no está del todo establecida, a diferencia de lo que se ha descrito en otras localizaciones³.

El propósito del estudio fue analizar la frecuencia de mutaciones puntuales del gen supresor de tumores TP53, en mucosa gástrica de pacientes con carcinoma gástrico y en mucosa adyacente con GAM.

Material y método

Muestra: se seleccionaron 46 pacientes consecutivamente operados por cáncer gástrico. Todos los casos fueron obtenidos del archivo de biopsias del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital de Temuco. Se realizaron cortes histológicos seriados de los bloques de parafina de tejidos previamente fijados en formalina tamponada. De acuerdo al nivel de infiltración en la pared los tumores fueron categorizados en incipientes (mucosa y submucosa), intermedios (túnica muscular propia) y avanzados propiamente tales (subserosa y serosa)¹⁶. La metaplasia intestinal fue estudiada en 20 de 46 piezas de gastrectomía, todos con carcinoma gástrico de tipo intestinal. No se consideraron áreas con displasia epitelial por la multifocalidad y el pequeño tamaño de las lesiones, lo que no permitió obtener DNA para realizar secuenciación.

Procesamiento del DNA y secuencia de gen TP53: se seleccionaron y rasparon manualmente desde los cortes histológicos sin desparafinizar áreas de linfocitos estromales (control), mucosa gástrica normal, mucosa gástrica atrófica, metaplasia intestinal y carcinoma, guiado por un corte histológico consecutivo teñido con hematoxilina y eosina. La extracción de DNA se efectuó con DNA Isolation Kit (Gentra, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La amplificación de los exones 5, 6, 7 y 8/9 del gen supresor de tumores TP53 fue hecha con los pares de iniciadores mostrados en la Tabla 1 ¹⁷. Previo a la secuenciación del DNA todo el producto de PCR fue separado en un gel de poliacrilamida al 12% por medio de electroforesis, con el propósito de aumentar la pureza y la concentración. La secuencia directa de todos los productos de PCR fue realizada con Sequenase versión 2.2 (Amersham Life Science Laboratories, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La electroforesis de los productos marcados con S35 fue realizada en un gel de poliacrilamida al 6% a 55°C. Posteriormente, los geles fueron fijados en una solución al 10% de metanol/ácido acético por 12 min y luego lavados por otros 12 min en agua deionizada. Finalmente, los geles fueron secados al vacío a 80°C y expuestos para autorradiografía por 24 a 48 h a temperatura ambiente (Kodak Biomax MR-1, USA).

Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizó por medio de prueba de Fisher y chi cuadrado. Se consideró diferencia significativa toda vez que el valor p <0,05.

Resultados

Se realizó secuencia de DNA de los 5 exones del gen supresor de tumores TP53 conocida como hot spot en todos los casos, considerando tanto tejido tumoral como áreas adyacentes con lesiones preneoplásicas (atrofia y/o metaplasia intestinal). Dado que la extracción de DNA fue hecha manualmente, la pequeña contaminación por linfocitos estromales implicó que en cada caso alterado la banda anormal se acompañó de una más débil en el nucleótido normal (Figura 1). Se descartó uno de los 46 casos dado que el alto contenido linfocitario pudo haber enmascarado alguna alteración del DNA en el tejido tumoral o pre-neoplásico.

La relación hombre:mujer fue 2,5:1. El promedio de edad fue 61 años y la relación intestinal: difuso fue 0,8:1. De acuerdo al nivel de infiltración, 7 casos fueron incipientes (16%), 3 intermedios (6%) y 35 avanzados (78%). Finalmente, 67% presentaron metástasis ganglionares linfáticas.

Figura 1. Secuencia de ADN del gen supresor de tumores TP53 con substitución nucleotídica simple en el exón 5, caso 1 (TGC a TAC).

En 14 de 45 pacientes (31%) se demostró una o dos alteraciones en la secuencia de DNA de los exones 5-9 del gen TP53. De éstas, 13 casos (29%) correspondieron a áreas con carcinoma y dos en áreas con metaplasia intestinal (Tabla 2). Además, un paciente presentó mutación exclusivamente en la metaplasia intestinal, sin un hallazgo similar en su respectivo carcinoma. No se encontró mutación del gen TP53 en áreas de GAM sin metaplasia intestinal.

De los 13 carcinomas con mutaciones, 38% fueron de tipo intestinal y 62% de tipo difuso (no significativo, prueba c², p >0,05, Tabla 2). Por otro lado, de acuerdo al nivel de infiltración no encontramos mutaciones del gen TP53 en carcinomas incipientes o intermedios. Si se segregan los casos de acuerdo al nivel de infiltración, de acuerdo a si estos son avanzados propiamente tales (infiltración hasta la subserosa o serosa) y no avanzados (mucosa, submucosa o intermedios) se observan diferencias significativas en la frecuencia de mutaciones del gen TP53 (Fisher, p <0,05; Tabla 2).

La distribución de las mutaciones de los exones 5-9 del gen TP53 fue la siguiente: exón 5: siete mutaciones; exón 6: cuatro mutaciones; exón 7: tres mutaciones; exones 8/9: cinco mutaciones (total 19 mutaciones). La frecuencia de la substitución nucleotídica CpG fue 11%, las transiciones C por T fue 11% y las transiciones G por A fue 37% (Tabla 2). Finalmente, ocho de 19 (42%) mutaciones del gen TP53 fueron de tipo "sin sentido".

Discusión

El adenocarcinoma gástrico es la segunda causa de muerte por cáncer en el mundo¹⁸. En general, la incidencia es más alta en países en desarrollo, tales como Chile^19,20. Además, se ha descrito una marcada variabilidad en la distribución geográfica dentro de los mismos países^21,22. Finalmente, se ha demostrado en estudios epidemiológicos que en la etiología del cáncer gástrico es muy importante la acción de factores ambientales, particularmente aquellos que actúan en los primeros años de vida de los individuos¹⁹.

La frecuencia de mutaciones del gen TP53 en pacientes con carcinoma gástrico fue 31%, en el rango de lo publicado de series de países occidentales²³, pero inferior a lo observado en países con poblaciones en alto riesgo de desarrollar carcinomas gástricos, con frecuencias que, en general, sobrepasan el 50%³. Nuestros hallazgos son consistentes con la gradual declinación en la incidencia por cáncer gástrico que se ha observado en las últimas décadas en Chile²⁴, similar a la experimentada por otros países occidentales algunas décadas antes²³. Esta disminución en la frecuencia del cáncer se ha acompañado de otros cambios biológicos y morfológicos muy significativos, tales como un aumento en la proporción de los carcinomas de tipo difuso²⁵ y un aumento de los carcinomas gástricos del tercio superior en desmedro de los antiguamente comunes cánceres gástricos antrales^25,26, ambas condiciones que se podrían relacionar indirectamente con la frecuencia encontrada de alteraciones del gen TP53.

Además, como había sido previamente reportado por otros autores, se encontró a dos individuos con mutaciones del gen TP53 en áreas con metaplasia intestinal^17,27, lo que corresponde a 10% de las áreas con metaplasia intestinal. La existencia de estas alteraciones respalda la hipótesis que la metaplasia intestinal es por si misma una condición preneoplásica, potencialmente susceptible de ser transformada en un tumor maligno. De acuerdo a la teoría de los dos golpes de Knudson²⁸, la interrogante actual sería la secuencia y el tipo de alteración genética complementaria que debiera ocurrir para que una célula pierda ambos alelos del gen supresor de tumores TP53. De acuerdo a los datos disponibles la mutación del gen TP53 ocurre efectivamente en metaplasia intestinal (alteración de aparición eventualmente precoz). Sin embargo, dada su frecuencia relativamente baja (10%) y la inexistencia del mismo hallazgo en tumores gástricos incipientes o intermedios, es posible presumir que la mutación no correspondería a la forma más frecuente o a la única forma del primer golpe sobre el gen TP53 en las fases más tempranas de la carcinogénesis gástrica. Además, hay información que plantea como más probable que el primer golpe sobre el gen TP53 sea por medio de la pérdida de la heterozigosidad, con pérdida de material genético^29,30.

A diferencia de lo reportado en algunos estudios^14,31, pero con hallazgos similares a lo descritos por otros autores³², las mutaciones del gen TP53 sólo se encontraron en carcinomas gástricos serosos o subserosos. Tal discordancia está en consonancia con la relativamente baja frecuencia de alteraciones en el ámbito de metaplasia intestinal¹⁷, y a la presumible ocurrencia de otro tipo de alteraciones genéticas a nivel de este mismo gen, tal como ha sido señalado en otros órganos^14,33,34.

Las mutaciones puntuales con substitución de bases del gen TP53 en tumores malignos humanos son una de las alteraciones genéticas más frecuentes¹⁵. Este tipo de estudio proporciona información acerca de los mecanismos involucrados en la carcinogénesis gástrica. Al igual que lo sucedido con otros hallazgos del presente trabajo, el tipo de mutación más frecuente -la transición- es similar a lo comunicado en países occidentales, con menor riesgo de carcinoma²³, discordante también con la forma más frecuente en países de alto riesgo, donde se describen más comúnmente mutaciones de tipo transversión^35,36. Este hallazgo distintivo ha sido previamente asociado con carcinogénesis gástrica relacionada a compuestos del tipo N-nitrosamina, los cuales pueden estar relacionados con la dieta o ser producidos bajo determinadas condiciones por la propia mucosa gástrica^37,38.

La mayoría de las mutaciones encontradas fueron silentes. Es decir, el cambio nucleotídico no implica una modificación en el producto proteico del gen TP53. Sin embargo, todos los casos fueron examinados con un control interno, lo cual implica que la "alteración" encontrada es una modificación somática adquirida. Si bien son ciertas estas mutaciones silentes no implican una alteración de la proteína p53, tales hallazgos brindan información muy útil para la interpretación de las vías de la carcinogénesis gástrica. La explicación de este fenómeno podría ser la expansión clonal de las neoplasias, dado que en éstas se producen constantemente múltiples alteraciones genotípicas, las cuales pueden no ser tanto responsables de la neoplasia propiamente tal sino que la resultante de la aparición de nuevos subclones que logran progresar dentro del mismo tumor.

En general, los dinucleótidos CpG son áreas de mayor frecuencia de substitución nucleotídica³⁹. Además, existen publicaciones de cáncer gástrico que indican una mayor frecuencia de transiciones C-por-T que G-por-A en los islotes CpG^17,40,41. En nuestros resultados predominan las transiciones por sobre las transversiones, pero la substitución a nivel de los islotes nucleotídicos CpG alcanza sólo hasta el 11%, similar a los hallazgos publicados previamente^3,33.

Uno de los mecanismos mediante el cual Helicobacter pylori participa en la carcinogénesis gástrica es el aumento de la proliferación de las células epiteliales gástricas, tanto por daño celular directo como indirecto, a través de la producción de un proceso inflamatorio de tipo mixto⁴² y una respuesta inmune de tipo Th1⁴³. Al respecto, individuos con cáncer gástrico de tipo difuso presentan asociación entre infección por Helicobacter pylori CagA+ y mutaciones del gen TP53^44,45. Por otro lado, se ha propuesto, paradojalmente, que la presencia de mutación germinal del gen TP53 protege al estómago de la aparición de un cáncer gástrico, lo que se fundamentaría en que en estos individuos la respuesta inmune ante la infección por Helicobacter pylori sería de tipo Th2, la que junto con provocar una respuesta basada predominantemente en la producción de anticuerpos anti-Helicobacter, poseería la ventaja de erradicar este germen de la mucosa gástrica, situación que no ocurre cuando la respuesta es de tipo Th1⁴⁶. El tipo de daño genético inducido directa o indirectamente por Helicobacter pylori necesita ser estudiado con mayor acuciosidad, tanto en zonas de bajo como de alto riesgo de cáncer gástrico, tanto en lo relativo al gen TP53 como a otros genes que participan en la cascada molecular de la carcinogénesis gástrica.

El número de casos es limitado y la experiencia involucra a sólo una localidad del país. Sin embargo, los resultados muestran en forma consistente una mayor similitud en la alteración biológica del gen TP53 a la de países occidentales con menores incidencias de cáncer gástrico que la descrita para Chile en general y la región de la Araucanía en particular. Nuevos trabajos colaborativos deberán llevarse a cabo para confirmar tal aseveración, aglutinando áreas geográficas de mayor extensión y con diferentes niveles de riesgo para cáncer gástrico.

Referencias

1. Laurén P. The two histological main types of gastric carcinoma: diffuse and so-called intestinal type carcinoma. An attempt at a histo-clinical classification. Acta Path Microbiol Scand 1965; 64: 31-49.

2. Correa P, Shiao YH. Phenotypic and genotypic events in gastric carcinogenesis. Cancer Res 1994; 54: 1941s-3s.

3. Tahara E. Molecular biology of gastric cancer. World J Surg 1995; 19: 484-8.

4. Correa P. Chronic Gastritis: A clinico-pathological classification. Am J Gastroenterol 1988; 83: 504-9.

5. Dixon MF, Genta RM, Yardley JH, Correa P. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. Am J Surg Pathol 1996; 20: 1161-81.

6. Nowell P. The clonal evolution of tumor cell populations. Science 1976; 194: 23-8.

7. Sidransky D, Mikkelsen T, Schwechhelmer K, Rosenblum M, Cavanee W, Vogelstein B. Clonal expansion of p53 mutant cells is associated with brain tumor progression. Nature 1992; 355: 846-7.

8. Correa P. Human Gastric Carcinogenesis: A Multistep and Multifactorial Process. First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention. Cancer Res 1992; 52: 6735-40.

9. Tahara E. Genetic alterations in human gastrointestinal cancers. The application to molecular diagnosis. Cancer 1995; 75: 1410-7.

10. Endoh Y, Sakata K, Tamura G, Ohmura K, Ajioka Y, Watanabe H et al. Cellular phenotypes of differentiated-type adenocarcinomas and precancerous lesions of the stomach are dependent on the genetic pathways. J Pathol 2000; 191: 257-63.

11. Imazeki F, Omata M, Nose H, Ohto M, Isono K. p53 gene mutations in gastric and esophageal cancers. Gastroenterol 1992; 103: 892-6.

12. Seruca R, David L, Holm R, Nesland J, Fangan B, Castedo S et al. p53 mutations in gastric carcinomas. Br J Cancer 1992; 65: 708-10.

13. Rhyu MG, Park WS, Jung YJ, Choi SW, Meltzer SJ. Allelic deletions of MCC/APC and p53 are frequent late events in human gastric carcinogenesis. Gastroenterology 1994; 106: 1584-8.

14. Strickler JG, Zheng J, Shu Q, Burgart LJ, Alberts SR, Shibata D. p53 mutations and microsatellite instability in sporadic gastric cancer: when guardians fail. Cancer Res 1994; 54: 4750-5.

15. Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris C. p53 mutations in human cancers. Science 1991; 49: 49-53.

16. Fujita S. Biology of early gastric carcinoma. Pathol Res Pract 1978; 163: 297-309.

17. Shiao YH, Rugge M, Correa P, Lehmann HP, Scheer WD. p53 alteration in gastric precancerous lesions. Am J Pathol 1994; 144: 511-7.

18. Parkin D, Pisani P, Ferlay J. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 1999; 49: 33-64.

19. Correa P. The epidemiology of gastric cancer. World J Surg 1991; 15: 228-34.

20. Boffetta P, Parkin D. Cancer in developing countries. CA Cancer J Clin 1994; 44: 81-90.

21. Parker S, Tong T, Bolden S, Wingo P. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 1996; 46: 5-27.

22. Haenszel W, Correa P. Developments in the epidemiology of stomach cancer over the past decade. Cancer Res 1975; 35: 3452-9.

23. Powell S. Stomach cancer. In: Vogelstein B, Kinzler K, editors. The Genetic Basis of Human Cancer. New York: McGraw-Hill; 1998; 647-52.

24. Medina E. Diseases of the digestive system in Chile. Rev Méd Chile 1988; 116: 282-8.

25. Araya J, Roa I, Aretxabala X, Salinas C. Gastric cancer in the ninth region of Chile: analysis of 233 cases. Rev Méd Chile 1989; 117: 773-9.

26. Csendes A, Smok G, Medina E, Salgado I, Rivera R, Quitral M. Clinical course characteristics of gastric cancer 1958-1990. Rev Méd Chile 1992; 120: 36-42.

27. Ochiai A, Yamauchi Y, Hirohashi S. p53 mutations in the non neoplastic mucosa of the human stomach showing intestinal metaplasia. Int J Cancer 1996; 69: 28-33.

28. Knudson A. Hereditary cancer, oncogenes and antioncogenes. Cancer Res 1985; 45: 1437-43.

29. Kobayashi K, Okamoto T, Takayama S, Akiyama M, Ohno T, Yamada H. Genetic instability in intestinal metaplasia is a frequent event leading to well differentiated early adenocarcinoma of the stomach. Eur J Cancer 2000; 36: 1113-9.

30. Kanai Y, Ushijima S, Ochiai A, Eguchi K, Hui A, Hiroashi S. DNA hypermethylation at the D17S5 locus is associated with gastric carcinogenesis. Cancer Lett 1998; 122: 135-41.

31. Tahara E, Semba S, Tahara H. Molecular biological observations in gastric cancer. Semin Oncol 1996; 23: 307-15.

32. Wright PA, Williams GT. Molecular biology and gastric carcinoma. Gut 1993; 34: 145-7.

33. Semba S, Ouyang H, Han SY, Kato Y, Horii A. Analysis of the candidate target genes for mutation in microsatellite instability-positive cancers of the colorectum, stomach and endometrium. Int J Oncol 2000; 16: 731-7.

34. Tamura G, Sakata K, Maesawa C, Suzuki Y, Terashima M, Satoh K et al. Microsatellite alterations in adenoma and differentiated adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res 1995; 55: 1933-6.

35. Hsieh LL, Hsieh JT, Wang LY, Fang CY, Chang SH, Chen TC. p53 mutations in gastric cancers from Taiwan. Cancer Lett 1996; 100: 107-13.

36. Tahara E. Molecular mechanism of stomach carcinogenesis [editorial]. J Cancer Res Clin Oncol 1993; 119: 265-72.

37. Mirvish SS. Role of N-nitroso compounds (NOC) and N-nitrosation in etiology of gastric, esophageal, nasopharyngeal and bladder cancer and contribution to cancer of known exposures to NOC. Cancer Lett 1995; 93: 17-48.

38. Poremba C, Yandell DW, Huang Q, Little JB, Mellin W, Schmid KW et al. Frequency and spectrum of p53 mutations in gastric cancer, a molecular genetic and immunohistochemical study. Virchows Arch 1995; 426: 447-55.

39. Cooper D, Krawczak M. Cytosine methylation and the fate of CpG dinucleotides in vertebrate genomes. Hum Genet 1989; 83: 181-8.

40. Seruca R, David L, Castedo S, Veiga I, Borresen AL, Sobrinho Simoes M. p53 alterations in gastric carcinoma: a study of 56 primary tumors and 204 nodal metastases. Cancer Genet Cytogenet 1994; 75: 45-50.

41. Gleeson CM, Sloan JM, McManus DT, Maxwell P, Arthur K, McGuigan JA et al. Comparison of p53 and DNA content abnormalities in adenocarcinoma of the oesophagus and gastric cardia. Br J Cancer 1998; 77: 277-86.

42. Blanchard TG, Czinn SJ. Review article: Immunological determinants that may affect the Helicobacter pylori cancer risk. Aliment Pharmacol Ther 1998; 12 Suppl 1: 83-90.

43. Beales IL, Calam J. Stimulation of IL-8 production in human gastric epithelial cells by Helicobacter pylori, IL-1beta and TNF-alpha requires tyrosine kinase activity, but not protein kinase C. Cytokine 1997; 9: 514-20.

44. Deguchi R, Takagi A, Kawata H, Inoko H, Miwa T. Association between CagA+ Helicobacter pylori infection and p53, bax and transforming growth factor-beta-RII gene mutations in gastric cancer patients. Int J Cancer 2001; 91: 481-5.

45. Hiyama T, Tanaka S, Kitadai Y, Ito M, Sumii M, Yoshihara M et al. p53 codon 72 polymorphism in gastric cancer susceptibility in patients with Helicobacter pylori associated chronic gastritis. Int J Cancer 2002; 100: 304-8.

46. Fox JG, Sheppard BJ, Dangler CA, Whary MT, Ihrig M, Wang TC. Germ line p53 targeted disruption inhibits helicobacter induced premalignant lesions and invasive gastric carcinoma through down regulation of Th1 proinflammatory responses. Cancer Res 2002; 62: 696-702.

Correspondencia a: Dr. Juan Carlos Araya. Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Casilla 54-D, Temuco, Chile. Teléfono: 56-45-296528. Fax: 56-45-216273. E-mail: jcaraya@ufro.cl