Rev Med Chile 2012; 140: 1132-1139

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Síndrome de Lynch: selección de pacientes para el estudio genético mediante análisis de inestabilidad microsatelital e inmunohistoquímica

 

Lynch syndrome: selection of families by microsatellite instability and immunohistochemistry

 

Ana María Wielandt¹, Alejandro J Zárate¹, Claudia Hurtado¹, Paulina Orellana¹, Karin Álvarez¹, Eliana Pinto¹, Luis Contreras², Alejandro Corvalán³, Udo Kronberg¹, Francisco López-Köstner¹

¹Unidad de Coloproctología. Laboratorio de Oncología y Genética Molecular.

²Servicio de Anatomía Patológica, Clínica Las Condes. Santiago, Chile.

³Departamento de Anatomía Patológica, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Correspondencia a:

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Background: Selection of patients with Lynch Syndrome (LS) for a genetic study involves the application of clinical criteria. To increase the rate of identification of mutations, the use of molecular studies as Microsatellite Instability (MSI) and Im-munohistochemistry (IHC) in the tumor has been proposed. Aim: To demonstrate the usefulness of MSI and IHC in the detection of mutations in patients with LS. Material and Methods: From our Familial Colorectal Cancer Registry, families suspected of LS were selected according to Amsterdam or Bethesda clinical criteria. Screening of germline mutations of MLH1, MSH2 and MSH6 genes was performed. In addition, analysis of MSI and IHC were performed in colorectal tumors. Results: A total of 35 families were studied (19 met Amsterdam and 16 met Bethesda criteria). Twenty one families harbored a germline alteration in MLH1, MSH2 or MSH6 (18 Amsterdam and 3 Bethesda). In these families, eighteen different alterations were found, 15 of which were mutations and 3 corresponded to variants of uncertain pathogenicity. On the other hand, 80% of the tumors showed positive microsatellite instability (27 MSI-high and 1 MSI-low), and immunohistochemical testing showed that 77% of tumors had the loss of a protein. Correlation between results of tumor molecular studies and the finding of germline nucleotide change showed that IHC and MSI predicted mutations in 81 and 100% of patients, respectively. Conclusions: MSI and IHC can efficiently select patients with a high probability of carrying a mutation in DNA repair genes.

Key words: Colorectal neoplasms, hereditary non polyposis; Lynch syndrome; Microsatellite instability.

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El cáncer colorrectal (CCR) se encuentra entre las primeras 4 causas de mortalidad en países desarrollados¹ y en Chile está dentro de las primeras 5 causas tanto en hombres como en mujeres². Se estima que entre 6 y 8% de los casos de CCR corresponden a un síndrome hereditario³, el más común de estos síndromes es el cáncer colorrectal hereditario no poliposo (CCHNP) o síndrome de Lynch (SL)⁴.

El SL es una enfermedad con herencia autosómica dominante, que se caracteriza por un riesgo aumentado de desarrollo de CCR a edades más tempranas y de localización principalmente proximal (colon derecho), en comparación con los casos de CCR esporádico. Además, este síndrome se caracteriza por un riesgo aumentado de desarrollo de otros cánceres en diversos órganos, tales como: endometrio, ovario, estómago, intestino delgado, urotelio, cerebro y piel^4,5. Por lo tanto, el definir si una persona es portadora de este síndrome es determinante para optimizar el manejo médico y seguimiento clínico. La identificación de familias sospechosas de SL se realiza a través de criterios clínicos, conocidos como Amsterdam⁶ y Bethesda⁷ (Tabla.1). Este síndrome se origina por una mutación en uno de los genes que codifican para enzimas que participan en el sistema de reparación de errores del ADN⁸. Los genes MLH1 o MSH2 se encuentran mutados en 90% de los casos con SL, en tanto que otros genes como MSH6 y PMS2 podrían dar cuenta del resto de las mutaciones⁴.

Tabla 1. Criterios de selección de familias sospechosas de Síndrome de Lynch (CCHNP)

Uno de los marcadores moleculares que ha sido utilizado en el SL para revelar de forma indirecta la probable presencia de mutaciones en la línea germinal, es el estudio de inestabilidad microsatelital (MSI) en el tejido tumoral colorrectal^9,10. Los microsatélites son regiones del ADN con múltiples repeticiones de uno a ocho nucleótidos (por ejemplo, AAAAA o CGCGCGCG). Estos microsatélites son particularmente susceptibles a errores durante el proceso de replicación del ADN, los cuales son corregidos por un sistema de reparación, sin embargo, cuando este sistema se encuentra dañado, estos errores permanecerán¹¹, lo que se reflejará en un aumento o disminución de la longitud de los microsatélites en el tejido tumoral comparado con el tejido normal^12,13.

Otro marcador molecular sugerido para la pesquisa de pacientes con SL, es la detección de la expresión de las proteínas involucradas en el sistema de reparación del ADN mediante la técnica de inmunohistoquímica (IHQ). Generalmente una mutación en la línea germinal conlleva una pérdida de expresión de la proteína en el tejido tumoral, ya sea por degradación de ésta o porque la proteína expresada (trunca) no es detectable por los anticuerpos utilizados¹⁴.

El objetivo de este estudio es evaluar la utilidad de la MSI y la IHQ para tamizar a pacientes con sospecha clínica de SL y así definir la mejor estrategia de estudio aplicable a este grupo de pacientes, en un país con recursos limitados como Chile.

Materiales y Métodos

Pacientes

Se seleccionaron los pacientes índices de 35 familias del Registro de Cáncer Colorrectal Familiar, reclutados desde el año 2003 al 2010, provenientes de diferentes lugares del país. Las familias fueron clasificadas según el cumplimiento de los criterios clínicos de Amsterdam o Bethesda. Todos los pacientes firmaron consentimiento informado.

Extracción de ADN

La extracción de ADN genómico para el análisis mutacional de la línea germinal se realizó a partir de una muestra de sangre periférica utilizando el método descrito por Lahiri y Nurnberger¹⁵. Del mismo paciente, el ADN tumoral fue extraído a partir de tejido fijado en formalina y embebido en parafina. El tejido tumoral fue reconocido en secciones teñidas con hematoxilina-eosina. Luego, desde cortes seriados de 8 m de espesor no teñidos, se obtuvieron las células tumorales a partir de las cuales se extrajo el ADN mediante el kit de extracción QIAmp DNA FFPE Tissue de QIAGEN según instrucciones de manufactura.

Análisis de mutaciones y rearreglos genómicos en los genes MLH1, MSH2 y MSH6

La identificación de mutaciones en los genes MLH1, MSH2 y MSH6 fue realizada mediante amplificación por PCR seguido del análisis de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms). Todos los partidores utilizados fueron previamente descritos^16,17. Pacientes sin mutación identificada mediante esta metodología fueron analizados para la búsqueda de grandes rearreglos genómicos en los genes MLH1 y MSH2 utilizando la técnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), con el kit SALSA P003 (MRC-Holland) que analiza los genes MLH1 y MSH2. El análisis fue realizado de acuerdo a las instrucciones de manufactura¹⁸.

Análisis de MSI

El análisis de inestabilidad microsatelital se determinó mediante la amplificación por PCR de los cinco marcadores microsatelitales recomendados por el National Cancer Institute (NCI) para el cáncer colorrectal: los mononucléotidos Bat-25, Bat-26 y los dinucleótidos D2S123, D3S1029, D5S346^19,20. Cada marcador microsatelital fue amplificado a partir de ADN tumoral y ADN control obtenido a partir de sangre periférica del mismo paciente utilizando partidores marcados con fluoróforos según lo descrito^21-23. La reacción de PCR fue realizada con 40 ciclos a 55°C en un volumen total de 25ul. La mezcla de reacción contiene: Buffer 1X PCR (50mM KCl, 20mM Tris HCl pH 8,3), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM de cada partidor 0,2 mM de cada dNTP, y 0,6 u de Polimerasa Taq Platinum (Invitrogen). Los microsatélites amplificados fueron separados por electroforesis capilar mediante el secuenciador ABI 310. Los resultados de la separación en el secuenciador se obtuvieron mediante el software Gene Mapper 4.0 de Applied Biosystems. Los tumores que presentan 2 o más microsatélites (> 30%) con un número de alelos aumentado (inestables) y/o alteración en el patrón de migración son considerados como MSI-alto, tumores con sólo un microsatélite inestable son considerados como MSI-bajo y los tumores que no presentan microsatélites inestables se consideran como estables (MSS)¹⁹.

Análisis de inmunohistoquímica

La evaluación de la expresión de las proteínas MLH1, MSH2 y MSH6 en el tumor fue realizada por IHQ en secciones de tejido fijado en formalina y embebido en parafina. El análisis IHQ fue realizado en el laboratorio de anatomía patológica de la Pontificia Universidad Católica de Chile para los pacientes reclutados entre el 2003 y el 2007 y en Clínica Las Condes para aquellos desde el 2008 al 2010. Cortes histológicos fueron montados en portaobjetos con carga positiva y desparafinados. Los pacientes procesados durante el período del 2003 al 2007 fueron evaluados utilizando los anticuerpos para MLH1 (policlonal Ab-2,cat#PC56) y MSH2 (Monoclonal Ab-2 cat #NA27) de Oncogene Research Products según lo descrito previamente¹⁵ y durante los años 2008 al 2010 se utilizaron anticuerpos de Dako (clone ES05) Novocastra (clone 25D12, dilución 1:50) y Cell Marque (clone 44, dilución 1:50) para MLH1, MSH2 y MSH6 respectivamente. Brevemente, la recuperación de la inmunoreactividad en PT link (Dako) se realizó durante 20 min a 95°C en una solución de alto pH del kit EnVision (Dako). La tinción IHQ se realizó de forma automatizada en el Autostainer 48 (Dako) usando el kit EnVision (Dako) según las instrucciones del fabricante. Para el contraste nuclear se utilizó hematoxilina de Mayer. Se consideró como tinción negativa o ausencia de la expresión de la proteína cuando menos del 10% de las células tumorales demostraron un patrón de tinción nuclear.

Resultados

En este estudio fueron analizadas un total de 35 familias sospechosas de SL, 19 cumplían con los criterios Amsterdam y 16 cumplían con los criterios Bethesda. Los estudios genéticos revelaron que 21 familias sospechosas del SL (18 Amsterdam y 3 Bethesda) portaban un cambio nucleotídico, con una tasa de detección de 60% (18/19, 95% para familias Amsterdam y 3/16, 19% en familias Be-thesda). Las alteraciones fueron localizadas principalmente en el gen MLH1 (14/21, 67%), seguido del gen MSH2 (5/21, 24%) y del gen MSH6 (2/21, 9%). Se observó un efecto patogénico debido a pérdida de dominios funcionales importantes en 18/21 alteraciones, en tanto que 3 cambios correspondieron a variantes de patogenicidad incierta (familias 2, 21 y 28) (Tabla.2).

Tabla 2. Análisis de inestabilidad microsatelital e inmunohistoquímica en el tejido tumoral de familias con estudio de mutaciones en la línea germinal

El análisis de MSI en los tumores colorrectales reveló que 28 de las 35 familias (80%) presentaban inestabilidad microsatelital, 27 fueron MSI-alto y 1 fue MSI-bajo, en 75% de ellas (21/28) se identificó una mutación. Los tumores con MSI fueron principalmente encontrados en familias que cumplen con los criterios de Amsterdam (95% comparado con 62,5% de las familias Bethesda) (Tabla.3). El único tumor con MSI-bajo corresponde a un paciente Bethesda sin mutación identificada. La correlación de los resultados de MSI con el hallazgo del estudio genético de la línea germinal demostró que 100% de los pacientes con mutación o variante alélica identificada, presentan MSI-alta.

Tabla 3. Familias sospechosas de Síndrome de Lynch según criterios clínicos, resultados de la MSI en el tumor y presencia de mutación en línea germinal

El análisis de IHQ demostró la pérdida de expresión en el tejido tumoral de al menos una de las proteínas en 27 pacientes (77%) y en el 63% (17/27) de ellas se identificó una mutación. De los 27 pacientes con pérdida de la expresión de la proteína, 19 tuvieron pérdida de MLH1, 3 de MSH2 y 1 de MSH6, y en 4 casos se observó la pérdida de más de una proteína (2 casos MSH2 y MSH6, 1 caso MLH1 y MSH2, 1 caso MLH1 y MSH6) (Tablas.2 y 4).

Tabla 4. Familias sospechosas de Síndrome de Lynch según criterios clínicos, resultados de la IHQ en el tumor y presencia de mutación en línea germinal

La correlación de los resultados de IHQ con el hallazgo de mutación de la línea germinal demostró que 17/21 (81%) pacientes tienen pérdida de expresión de la proteína cuyo gen es portador de una mutación o variante alélica. En cuatro casos no observamos esta correspondencia ya sea porque no se observó la pérdida de las proteínas (familia 11) o bien porque la proteína perdida no correspondía al gen mutado (familias 4, 21 y 27) (Tabla.2).

Discusión

Se ha establecido que las familias candidatas a estudios genéticos deben ser preseleccionadas mediante su historia familiar, análisis de IHQ y de MSI para aumentar el éxito en el hallazgo de mutaciones en los pacientes con SL ahorrando tiempo y costo en los estudios^24-26. Una de las limitaciones respecto de los antecedentes familiares, es que en ocasiones la información que expresan los familiares no es exacta.

Los resultados de nuestro trabajo demuestran que el criterio de selección más estricto (Amsterdam) presentó una mayor probabilidad de identificación de alteraciones en la línea germinal al comparar con la utilización del criterio Bethes-da (95% versus 19%). Destacamos que la única familia Amsterdam (familia 26) que no presenta inestabilidad en los microsatélites (MSS) podría corresponder a un Síndrome Familiar Colorrectal tipo X, cuya causa genética no ha sido identificada a la fecha^27,28.

La correlación de este estudio con los criterios clínicos demostró que 95% de las familias que cumplen con los criterios de Amsterdam (18/19) tiene MSI alta y sólo 62,5% (10/16) de las familias Bethesda presentan tumores con MSI. Si el estudio genético hubiera sido realizado sólo en este grupo de pacientes con tumores con MSI, el porcentaje de identificación de alteraciones en la línea germinal habría aumentado de 95% (18/19) a 100% (18/18) en las familias Amsterdam y de 19% (3/16) a 30% (3/10) en las familias Bethesda.

La correlación de los resultados de IHQ con los criterios clínicos demostró que 79% (15/19) de las familias Amsterdam sufren la pérdida de la expresión de la proteína cuyo gen presenta una mutación, mientras que sólo en 25% (2/8) de las familias Bethesda se observó esta correlación. Esta observación confirma la utilización del criterio clínico de Amsterdam como primera opción de tamizaje.

En los casos de las familias 4 y 11, las mutaciones identificadas se encuentran localizadas al final del gen MLH1 (deleción del exón 19 y un cambio aminoacídico en el exón 18, respectivamente), sin embargo, no se observa ausencia de la proteína correspondiente. Esto se puede explicar ya que la proteína puede estar presente, pero no necesariamente ser funcional.

En el caso de las familias 21 y 27 los cambios se identificaron en el exón 2 del gen MSH6 (un cambio aminoacídico de patogenicidad incierta) y en el exón 7 del gen MSH2 (una proteína con término prematuro), respectivamente; sin embargo, en ambos casos, la IHQ demostró ausencia sólo de MLH1. La detección de las respectivas proteínas por IHQ se puede deber a que en ambos casos, se mantuvo el sitio de reconocimiento de los anticuerpos, y la ausencia de MLH1 observada se puede deber a una alteración de la antigenicidad de la proteína en los tumores debido al tiempo de fijación en formalina como se ha propuesto en otros trabajos^29-31 ya que estos provienen de distintos centros del país con distintos protocolos de fijación.

Se ha descrito que otros factores que pueden afectar los resultados de la IHQ mostrando discrepancia entre el hallazgo de mutación y la pérdida de la proteína, pueden explicarse por epimutaciones constitucionales del gen MLH1 o MSH2 dando cuenta de un tercio de los casos de familias que cumplen con los criterios clínicos de CCHNP sin mutación identificada^32,33 o por hipermetilación del promotor del gen MLH1 en el tumor, que silencia la expresión de la proteína como podría ser el caso de las familias 14, 24, 30 y 39^34,35. También la pérdida de más de una proteína por pérdida del compañero de interacción MSH2/ MSH6 como son los casos de las familias 28 y 47 y la falta de evaluación de otros genes reparadores como PMS2. Por otra parte, las técnicas de SSCP y MLPA utilizadas no evalúan el promotor de los genes estudiados ni regiones alejadas de los sitios de unión intrón-exón ni la presencia de grandes deleciones en el gen MSH6 de manera que pueden quedar alteraciones sin identificar. Otra de las limitaciones del presente estudio es que este se extendió por un período prolongado de tiempo con un cambio de anticuerpos durante el estudio, lo que podría haber influido en los resultados de la IHQ. No obstante, a todos los pacientes se les realizó el estudio genético independiente de su resultado inmunohistoquímico.

En este trabajo, el estudio de MSI presenta una ventaja por sobre la IHQ, proporcionando información sobre la función de las proteínas independiente de su expresión. Sin embargo, no se evaluó el gen PMS2 que podría generar alta inestabilidad por ser una de las proteínas involucradas en el complejo de reparación del ADN, y podría explicar algunos casos en los cuales no se encontró mutación en los genes MLH1, MSH2 y MSH6. El incluir este gen dentro de los estudios genéticos y su determinación por IHQ podría aumentar el éxito de hallazgo de mutaciones y su correlación con el análisis IHQ.

Finalmente, los estudios genéticos para enfermedades hereditarias no se encuentran ampliamente disponibles e implican la utilización de recursos que son limitados. De acuerdo a nuestros resultados tanto la MSI como la IHQ son herramientas que ayudan al hallazgo de mutaciones en pacientes con sospecha de Síndrome de Lynch. Los estudios de MSI y de IHQ pueden seleccionar eficientemente pacientes con alta probabilidad de ser portadores de una mutación en los genes reparadores del ADN y conducir el estudio genético en familias con escasa historia familiar. Proponemos que en los pacientes que cumplen con los criterios de Amsterdam, se puede realizar el estudio genético directamente, evitando la realización de estudios moleculares en el tumor e iniciar los estudios por el gen MLH1 según se muestra en el algoritmo (Figura.1). Por otra parte, para aumentar la probabilidad de identificar una mutación en pacientes Bethesda, es necesario realizar el análisis de MSI e IHQ para seleccionar pacientes que requieran estudio genético y dirigir los estudios al gen candidato optimizando recursos y gastos en pacientes con baja probabilidad de éxito en el hallazgo de mutaciones.

Figura 1. Algoritmo para estudio genético de pacientes con sospecha de Síndrome de Lynch. MSI: inestabilidad microsatel i-tal. IHQ: inmunohistoquímica. *Estudio según resultado de la IHQ u orden establecido para pacientes Amsterdam.

Referencias

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Estudio parcialmente financiado por proyecto Fondecyt 1040827 y Clínica Las Condes.

Recibido el 3 de junio de 2011, aceptado el 9 de mayo de 2012.

Correspondencia:

Dr. Francisco López-Köstner Clínica Las Condes.

Lo Fontecilla 441

Teléfono: 2104771 Fax: 2104776

E-mail: flopez@clc.cl

 

Conflictos de Intereses:

Alejandro Corvalán.

Ana María Wielandt.

Alejandro Zarate.

Eliana Pinto.

Francisco López-Kostner.

Claudia Hurtado.

Karin Alvarez.

Luis Contreras.

Paulina Orellana.

Udo Kronberg.