Agricultura Técnica (Chile) 67(2):115-125 (Abril-Junio 2007)

INVESTIGACIÓN PRODUCCIÓN VEGETAL

RAPD e ITS Detectan Variación Molecular en Poblaciones Chilenea de Beauveria bassiana

RAPD and ITS Reveal Molecular Variation of Chilean Populations of Beauveria bassiana

Viviana Becerra V.¹*; Mario Paredes C.¹; Carmen Rojo M.¹; Andrés France I.¹

Financiamiento: Proyecto FONDECYT N°1030037.
1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile. E-mail: vbecerra@inia.cl *Autor para correspondencia.

Recibido: 9 de marzo de 2006.                                                          Aceptado: 20 de abril de 2006.

INTRODUCCIÓN

En la naturaleza los hongos entomopatógenos (HEP) pueden controlar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daños económicos a los cultivos (Azevedo y Melo, 1998). Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estiércol, suelo, y plantas, alcanzando un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con baja luminosidad. Los HEP son el grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos-plagas. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos (López y Börjes, 2001). Actualmente se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de HEP; entre los géneros más importantes están Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium (López y Börjes, 2001), siendo los más utilizados Beauveria (Zurek y Keddie, 2000; Mulock y Chandler, 2000) y Metarhizium (Ferron et al., 1991).

Desde 1996, el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), en el Centro Regional de Investigación (CRI) Quilamapu, Chillán, estableció un Programa de Patología de Insectos, cuyo objetivo fue prospectar, aislar e identificar organismos entomopatógenos a lo largo de Chile, para su uso como controladores biológicos de plagas (France et al., 2000). En esta colección se mantienen alrededor de 400 aislamientos de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin. Esta especie es de importancia mundial, ya que ha sido evaluada como agente controlador de varias especies de insectos-plagas de importancia económica (Maurer et al., 1997; Zurek y Keddie, 2000).

La colección de B. bassiana ha sido clasificada desde el punto de vista morfológico y en su eficiencia como controlador biológico (France et al., 2000; 2002) y necesita de una clasificación genética molecular para detectar diferencias a nivel de ADN y para complementar los datos morfológicos obtenidos.

En general, una de las principales desventajas de la caracterización morfológica es que las características a medir son limitadas en número, por lo cual la discriminación entre aislamientos es difícil. Por otro lado, la presencia de estas especies en diversos climas y condiciones agroecológicas, indicaría la existencia de una alta variabilidad genética en la especie.

Actualmente, la forma más certera de determinar los niveles de diversidad y estructura genética intraespecífica es a través del uso de marcadores moleculares. Principalmente se han usado cuatro tipos de marcadores moleculares para determinar la diversidad genética en HEP: los fragmentos de restricción polimórficos (RFLP) (Maurer et al., 1997), el ADN polimórfico amplificado al Azar (RAPD) (Piatti et al., 1998; Gaitan et al., 2002), las secuencias simples repetidas (SSR) (Kretzner et al., 2000); y los espaciadores internos transcritos (ITS), ITS 1 y 2 del rADN (Buscott et al., 1996; Coates et al., 2002). Todos estos marcadores han sido efectivos determinando diferencias genéticas entre aislamientos, pero en forma complementaria y con un poder de discriminación diferente entre ellos (Couteaudier et al., 1998). En Chile B. bassiana ha sido poco estudiada utilizando marcadores moleculares.

La metodología mayormente usada en estudios de diversidad genética han sido los RAPDs, técnica basada en PCR (Williams et al., 1990). En el caso específico de los HEP, los RAPDs han determinado la diversidad genética en dos especies del género Beauveria (Neuvéglise et al., 1994; Neuvéglise y Brygoo, 1994; Bidochka et al., 1995; Maurer et al., 1997). También estos marcadores han sido utilizados para asociar patrones específicos a índices de patogenicidad (Piatti et al., 1998; Valderrama et al., 2000; Sivaramakrishnan et al., 2002; Gaitan et al., 2002). Por otro lado, las secuencias ribosomales nucleares, especialmente los ITS 1 y 2, han mostrado tasas diferenciales en cambios nucleotídicos, lo cual permite la comparación de aislamientos a nivel inter e intraespecífico en hongos (Neuvéglise et al., 1994; Buscott et al., 1996; Iturralde, 2005). Para amplificar las regiones ITS 1 e ITS 2 se han diseñado partidores universales que amplifican estas zonas genéticamente conservadas para establecer su nivel de diversidad (White et al., 1990). Shih et al. (1995) indican que en B. bassiana existe un mayor nivel de mutación dentro de la región ITS 1, comparada con la región ITS 2, la cual no mostró variabilidad. Sin embargo, en otro estudio se encontró una mayor variación de secuencia en el ITS 2 de B. brogniartii, proveniente de un único huésped (Neuvéglise y Brygoo, 1994). Por otro lado, al menos cinco RFLPs se han detectado entre especies de Beauveria (Neuvéglise et al., 1994; Glare e Inwood, 1998) para las regiones ITS, consideradas como secuencias conservadas.

De acuerdo a lo anteriormente expuesto, en este estudio se plantean los siguientes objetivos: a) determinar el nivel de diversidad genética que existe en poblaciones de B. bassiana colectadas en diferentes regiones geográficas de Chile, mediante RAPD y PCR-RFLP de los ITS 1 y 2, intrones ubicados entre los genes rADN 28S y 18S; y b) determinar si existen patrones genéticos únicos para ser utilizados en la discriminación de aislamientos usados en control biológico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material genético
Del total de la colección criopreservada, se analizaron 36 accesiones de B. bassiana (Cuadro 1) mediante RAPD y PCR-RFLP de los ITS. Los aislamientos seleccionados se colectaron en diferentes regiones geográficas del país y a partir de diferentes fuentes de inóculo. El número de aislamientos analizados corresponde a un 10% de la colección existente para esta especie. El estudio se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de INIA Quilamapu, Chillán.

Cuadro 1. Aislamientos de Beauveria bassiana analizadas mediante RAPD¹ e ITS-rDNA².
Table 1. Beauveria bassiana isolates analized by RAPD¹ and ITS-rDNA².

A partir de aislamientos multi-espóricos, cultivados en placas Petri a 27°C por 3 días en medio PDA, se realizaron cultivos monospóricos. Vale decir, esporas únicas se cultivaron en medio líquido Sabouraud más 1% de extracto de levadura y se produjo el micelio para la extracción de ADN.

Extracción de ADN
El micelio se maceró con el tampón compuesto por: 100 mM Trizma; 1,4 M NaCl₂; 20 mM EDTA; 1% Polivinilpirrolidona y 2% CTAB, ajustado a un pH 8,0; a cada muestra se le agregaron 8 µL de proteinasa K. La mezcla se incubó a 65ºC por 60 min y se homogeneizó a intervalos de 10 min. Las muestras se dejaron enfriar y se mezclaron con cloroformo-isoamílico (24:1), posteriormente se centrifugaron a 5000 r.p.m. por 15 min, para la separación de fases, etapa que se realizó dos veces. El sobrenadante acuoso se transfirió de tubo y se le agregó isopropanol, las muestras se incubaron a -20ºC por toda la noche para precipitar el ADN. El pellet de ADN se colectó mediante centrifugación, se lavó con alcohol 70% y alcohol absoluto 90% para luego ser secado a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN se diluyó en TE pH 8,0 y se trató con ribonucleasa. Para verificar la calidad del ADN se realizó una electroforesis en agarosa al 1%; usando l HindIII como estándar de referencia.

Análisis de RAPD
Las condiciones de amplificación de los RAPD fueron de 40 ciclos de 35 s a 94°C, 35 s a 40°C y 1 min a 72°C, con un ciclo final de 10 min a 72°C (Termociclador PTC-220, MJ Research, Massachusetts, USA) . Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 µL que contenían 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 mM del partidor, 1x de tampón de amplificación de PCR, 0,3 mM of MgCl₂, 1 U Taq ADN polimerasa (Invitrogen) and 25 ηg of ADN molde en agua ultrapura. Las reacciones se realizaron dos veces para determinar la consistencia de los patrones obtenidos y para la selección de los partidores.

Los productos de la amplificación se separaron en un gel de agarosa (1,5%) en el tampón 1x TAE (40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8,0) a 100 V por 3,5 h. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron bajo la luz ultravioleta (Transluminador Cole Palmer, FLUO-LINK FLX, Francia) para su posterior evaluación.

Se realizó un pre-screening sobre cinco aislamientos de B. bassiana con 39 partidores de las series OPA-A, OPA-D, OPA-AB, and OPA-M (OPERON TECHNOLOGIES, California, USA).

Análisis de espaciadores internos transcritos (ITS)
Los partidores universales ITS 1, ITS 2, ITS 3, ITS 4 e ITS 5 se utilizaron para amplificar ADN de los aislamientos mediante PCR (White et al., 1990). La reacción de PCR se realizó en un volumen total de 25 µL, la cual contuvo 0,2 mM de dNTPs, 0,2 mM de los partidores ITS (3’ → 5’) y (5’ →3’), 1x de tampón de amplificación de PCR, 0,25 mM de MgCl₂, 1 U Taq ADN polimerasa (Invitrogen) y 25 ηg de ADN molde. La amplificación se realizó en el termociclador PTC-220 (MJ Research), donde el programa incluyó un ciclo inicial de 3 min a 94ºC, seguido por 35 ciclos de 30 sa 94ºC, 40 sa 57ºC, y 20 min a 72ºC. La restricción de los productos de PCR se realizó de acuerdo a protocolos de los distribuidores usando las siguientes enzimas endonucleasas: Acc I, Alu I, Dde I, Eco RI, Eco RV, Hae III, Hha I, Hinf I, Hpa II, Mbo I, MseI, Msp I, Nde II, Rsa I, Sin I, Tru 9I and Xho I. La reacción de digestión se realizó bajo las siguientes condiciones: 10 mL de ADN amplificado, 1x tampón (tampón enzima-específico) y 5 a 8 unidades de enzima de restricción. La incubación fue a 37°C en un tiempo adecuado a la enzima de restricción.

Los fragmentos generados por la restricción se separaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6% (20x20) en el tampón 1x TBE a 100 V por 2 h. El gel se tiñó con bromuro de etidio para visualizar los fragmentos bajo a luz UV. Los pesos moleculares de los fragmentos se determinaron usando como estándar la escalera de ADN de 100 pb y el programa 1D Image Analysis Program (Kodak).

Análisis de los datos
Para los RAPD e ITS, las bandas se consideraron como caracteres binarios y se evaluaron como “1” cuando hubo presencia y “0” cuando hubo ausencia de ellas. La similitud genética entre pares se estimó mediante el coeficiente de Jaccard con la opción SIMQUAL. La matriz de similitud se analizó a través del “Sequential, agglomerative, hierarchical and nested clustering” (SAHN) (Sneath y Sokal, 1973). Los dendrogramas se generaron usando el método jerárquico y el algoritmo de agrupamiento de UPGMA. El programa MXCOMP se usó para calcular la matriz de correlación cofenética entre la matriz de similitud y la matriz original para determinar si los datos originales estaban bien representados en el análisis de agrupamiento, bajo 1000 permutaciones. Todos los análisis se realizaron con el programa NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2000).

Para el análisis de RAPD e ITS, se determinó la existencia de patrones de bandas específicos para la identificación de aislamientos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis de RAPD en Beauveria bassiana
Veinte partidores de RAPD fueron seleccionados, basados en su reproducibilidad, después del pre-screening para analizar los 36 aislamientos de B. bassiana. Un total de 173 bandas fueron determinadas, de las cuales 98,3% fueron polimórficas. El número de bandas por partidor varió entre 3 (OPM-01) y 15 (OPA-13), con un promedio de 8,7 bandas por partidor. El rango de estos resultados concuerda con los datos obtenidos por Gaitan et al. (2002) en B. bassiana, lo cual indica la consistencia y utilidad de estos marcadores en estudios de diversidad genética.

Diez de los 20 partidores fueron los más informativos (OPA-13; OPD-18; OPAB-09; OPA-11; OPD-03; OPD-13; OPAB-06; OPAB-11; OPAB-14 and OPAB-18), con ellos se detectó un 68,8% del polimorfismo total. Estos partidores generaron el mayor número de patrones de bandas (entre 10 y 12), lo cual los sugiere como buenos partidores para hacer un “fingerprinting”.

El dendrograma de B. bassiana agrupó los 36 aislamientos con un promedio de similitud de 42,3% (Figura 1). En la figura se observan dos grupos principales. El primero de ellos incluyó 27 aislamientos (desde Qu-B72 a Qu-B330), este grupo incluyó aislamientos colectados en el norte (I Región), centro (V, VI, VII Regiones) y sur del país (VIII y X Regiones), incluyendo dos aislamientos colectados en la Isla de Pascua (Qu-B911 y Qu-B903). El promedio de similitud de este grupo fue de un 70%, lo cual indica una variabilidad genética intermedia a baja. Veintiséis de estos aislamientos fueron colectados desde el suelo y uno de un adulto de Listronotus bonariensis.

Figura 1. Dendrograma generado por análisis de RAPD en aislamientos de Beauveria bassiana chilena.
Figure 1. Dendrogram from RAPD analysis of Chilean Beauveria bassiana isolates.

El segundo grupo, de nueve aislamientos (desde Qu-B314 a Qu-B798c), fue colectado en el área sur del país, con la excepción de Qu-B798c que es de la VI Región (Figura 1). Glare e Inwood (1998) indican que el origen geográfico influenció el número de haplotipos observados y la estructura genética de B. bassiana cuando la comparación se realizó entre aislamientos endógenos de Nueva Zelanda y Europa y entre Nueva Zelanda y América del Sur. Por otro lado, Coates et al. (2002) sugieren que la geografía puede no jugar un rol sobre la diversidad genética, dependiendo del caso. En este grupo, cinco de los nueve aislamientos fueron colectados de diferentes insectos: larvas de Curculionideae, Cydia pomonella, Dalaca pallens, Urocerus sp. y Polister gallicus (Figura 1).

El agrupamiento de las poblaciones indicó una escasa asociación entre el origen geográfico de los aislamientos y la diversidad genética. Por ejemplo, Qu-B390 colectada en la VII Región (Pelluhue, lat. 35°49’) fue genéticamente similar a Qu-B768 de la X Región (Puerto Ibañez, lat. 45°45’) (Figura 1). Por otro lado, dentro de este primer grupo, algunos aislamientos provenientes de la misma región fueron genéticamente distintos entre ellos. Es así como Qu-B295, Qu-B306 y Qu-B323, provenientes de la I Región (Arica) no fueron agrupados juntos, aunque Qu-B295 y Qu-B299 fueron los más cercanos genéticamente, ambos colectados en la misma localidad de Chungará (lat. 18°15’) (Figura 1). Este hecho confirma que los aislamientos chilenos de B. bassiana tienen una amplia diversidad genética dentro y entre regiones del país (Figura 1). Esta diversidad entre regiones ha sido también detectada en B. brongniartii (Piatti et al., 1998).

El coeficiente de correlación cofenético entre la matriz cofenética y los datos originales de los RAPD fue de 0,92. Este valor fue alto y mostró que la matriz original está bien representada en el dendrograma.

Análisis de ITS en Beauveria bassiana
Las regiones ITS 1 e ITS 2 fueron amplificadas por los partidores universales, 1-2 y 3-4, respectivamente (White et al., 1990). En ambas regiones se generó un fragmento único en todos los aislamientos, los cuales fueron digeridos con varias enzimas de restricción. Estas enzimas generaron varias diferencias a nivel molecular entre los 36 aislamientos de B. bassiana. En la región ITS 1 con la enzima de restricción Alu I se detectaron fragmentos desde 230 a 220 pb, con Hae III desde 130 a 90 pb, con Hha I desde 240 a 220 pb, con Nde II desde 190 a 180 pb y con Hinf I desde 190 a 30 pb (Figura 2A, Cuadro 2). Hinf I fue la enzima de restricción que detectó el mayor número de sitios de restricción en ITS 1, generando un total de tres haplotipos (Cuadro 2). En conjunto, los productos de PCR de la región ITS 1 digerida por Alu I, Hae III, Hha I, Nde II y Hinf I detectaron un total de cuatro haplotipos.

Figura 2. Haplotipos observados en aislamientos chilenos de Beauveria bassiana mediante análisis de PCR-RFLP de las regiones ITS.
Figure 2. Haplotypes observed on Chilean Beauveria bassiana isolates by PCR-RFLP analysis of ITS regions.




Cuadro 2. Fragmentos de restricción (RFLP) observados después de la electroforesis PAGE de los aislamientos de Beauveria bassiana analizados mediante ITS-rDNA¹.
Table 2. Restriction fragments (RFLP) observed after PAGE electrophoresis of Beauveria bassiana isolates analized by ITS-rDNA¹.

Por otro lado, la digestión de la región ITS 2 con Alu I generó fragmentos desde 350 a 110 pb, con Hae III desde 190 a 70 pb y, con Hha I desde 290 a 80 pb (Figura 2B, Cuadro 2). Por otro lado, las tres enzimas detectaron dos haplotipos cada una (Cuadro 2). Las enzimas Nde II y Hinf I no detectaron sitios de restricción en la región ITS 2 de los aislamientos. En esta región, los productos de PCR digeridos por Alu I, Hae III y Hha I generaron en conjunto tres haplotipos en las aislaciones analizadas.

Mayor variabilidad fue detectada en la región ITS 1, hecho que se ha detectado en otras especies de hongos (Becerra et al., 2006; Kuninaga et al., 1997; Zare et al., 1999). Al analizar ambas regiones ITS, se detectaron cinco haplotipos en los 36 aislamientos de B. bassiana, sólo los aislamientos Qu-B798c y Qu-B798b, ambos provenientes de Pencahue, VI Región, tienen un haplotipo único y distinto al de los otros aislamientos.

Aunque el análisis de PCR-RFLP de las regiones ITS 1 y 2 detectó diversidad genética en esta especie, los aislamientos no fueron completamente discriminados entre ellos, como ocurrió con los 20 partidores de RAPD. Esta situación fue corroborada con el coeficiente de similitud promedio obtenido con los ITS (83,7%) (Cuadro 3), superior al 42,3% obtenido mediante RAPD.

Cuadro 3. Coeficientes de similitud entre pares de aislamientos de Beauveria bassiana, basados en el análisis de ITS-rDNA¹.
Table 3.   Similarity coefficients between Beauveria bassiana isolates, based on ITS-rDNA analysis¹.

El dendrograma indica la presencia de tres grupos distantes genéticamente y dos aislamientos separados genéticamente de los otros genotipos (Figura 3). Sin embargo, existe un alto porcentaje de aislamientos idénticos dentro de cada grupo (I, II y III). Por ejemplo, en el grupo I, 23 aislamientos (64%) presentaron el mismo haplotipo e incluye genotipos colectados en una amplia área geográfica, desde la I a la XII Regiones. Un segundo grupo incluyó tres aislamientos de diversas regiones y el tercer grupo de ocho aislamientos (22%), los cuales también presentaron un haplotipo idéntico. Dos aislamientos, Qu-B798b y Qu-B798c, fueron genéticamente diferentes al resto y se ubicaron separadamente del resto de los genotipos, aunque ambos provienen de una misma localidad. El coeficiente de correlación cofenético entre la matriz cofenética y los datos originales de los ITS fue de 0,98. Este valor fue alto al igual que con RAPD y mostró que la matriz original está bien representada en el dendrograma.

Figura 3. Dendrograma generado del análisis PCR-RFLP de las regiones ITS aislados de Beauveria bassiana chilenos.
Figure 3. Dendrogram from PCR-RFLP analysis of ITS regions of Chilean Beauveria bassiana isolates.

Es de importancia señalar que el dendrograma generado por los datos de ITS agrupó a los aislamientos de manera muy similar a los RAPD. Además, los ITS no determinaron una relación entre la diversidad genética de los aislamientos y el origen geográfico de éstos. El caso extremo fue el de los aislamientos Qu- B798a, Qu- B798b y Qu- B798c colectados desde el suelo en la localidad de Pencahue, Fundo Bagio, (lat 34°20’; 71°11’), VI Región. Estos aislamientos presentaron un patrón genético completamente distinto, aún para los ITS, marcadores moleculares que son considerados como conservados.

El análisis de las secuencias ribosomales del ADN (rADN), mediante el diseño de partidores de ITS específicos, ha probado ser eficaz en la resolución del perfil taxonómico del género Beauveria (Hegedus y Khachatourians, 1993; Hegedus et al., 1998) y en la identificación de razas en Metarhizium anisopliae var. anisopliae (Rodríguez et al., 2004).

Identificación de aislamientos
Al implementar un sistema de control biológico, es importante tener un buen sistema de identificación de los aislamientos que están siendo usados, como una forma de medir la eficiencia de la aplicación y determinar la posible infección que realizan las poblaciones naturales, junto al aislado aplicado en forma artificial (Coates et al., 2002).

En el caso específico de B. bassiana, los RAPD detectaron un mayor grado de diversidad entre los aislamientos. Resultados que concuerdan con aquellos obtenidos por Bidochka et al. (1994), quienes determinaron una gran variabilidad entre aislamientos.

Por otro lado, el uso de los ITS para fingerprinting es más conservador, vale decir, su capacidad discriminatoria es menor. Aunque este marcador detectó variabilidad en B. bassiana con una gran reproducibilidad, muchos de los aislamientos compartieron el mismo haplotipo, haciendo imposible la discriminación entre ellos. Con excepción de Qu-B798c, que fue identificado como genéticamente distinto al resto de los aislamientos, mediante RAPD e ITS.

Basados en estos resultados, los dos marcadores podrían ser usados en forma conjunta para identificar aislamientos de interés comercial. Como también sería recomendable el uso de otros marcadores para complementar este estudio.

CONCLUSIONES

Los RAPD e ITS detectaron variabilidad genética en aislamientos chilenos de Beauveria bassiana.

El análisis de RAPD detectó mayores niveles de diversidad que el análisis de los ITS.

Los RAPD e ITS, en general, no detectaron asociación entre los aislamientos provenientes de una misma región geográfica.

En Beauveria bassiana chilena, la región ITS 1 fue más variable que la región ITS 2.

Los ITS detectaron una escasa diversidad genética en aislamientos chilenos de Beauveria bassiana, por lo cual la discriminación entre aislamientos no fue posible.

RECONOCIMIENTOS

Los autores desean agradecer a la Ingeniero Agrónomo Sra. Macarena Gerding y a la Técnico Forestal, Sra. Cecilia Santelices por su colaboración em el cultivo de los HEP.

LITERATURA CITADA

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