Estudio enzimático y anatomopatológico de ponedoras alimentadas con semilla de Lupinus albus (dulce y amarga) durante 22 semanas*
 

J.C. LOPEZ1, M.V.; V. CUBILLOS¹, M.V., Ph.D.; A. CUBILLOS¹, M.V. M. Sc.; I. MOLINA², Estadístico;
H. BÖHMWALD³, T.M.

¹Inst. Patología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias.² Inst. Estadística, Facultad de Ciencias Económicas
y Administrativas. ³Inst. Ciencias Clínicas Veterinarias, Facultad de Ciencias Veterinarias,
Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.
 

SUMMARY

Enzymatic and anatomopathological study of laying hens feeding on Lupinus albus seeds
(sweet and bitter) for 22 weeks

The effect produced by the incorporation of Lupinus albus var. Multolupa seeds in the rations of laying hens was studied.

One hundred and sixty (34 week old) White Leghorn hens (Shaver Starcross 288) were divided into 4 groups. These hens were fed with a basal diet plus 10% lupine seeds, with different percentages of alkaloids, for 22 weeks. The hens were kept in individual coops. They were fed daily with 112.5 g/fowl and water was given ad-libitum.

The enzymatic study was carried out by measuring the activity of aspartate-aminotransferase, alanine-aminotransferase and alkaline phosphatase enzimes. Liver, brain and kidney samples were collected in order to perform macro and microscopic analysis. A mortality record was kept.

There were no enzymatic values indicating disorder in the hepatic functions due to the lupine seeds. The main morphological alterations were degenerative and necrotic changes in the brain. Degenerative changes were observed in the tubular portions of the kidney. In similar proportions, within the groups, degenerative changes were observed in the liver.

In conclusion, the bitter lupine seeds (2.63% of total alkaloids), incorporated as 10% of the ration of laying hens, during the first phase of laying, do not produce alterations in the tissues examined.

Palabras claves: gallinas, lupino, alcaloide, enzima, patología.

Key words: hens, lupine, alkaloid, enzyme, pathology.
 

INTRODUCCION

Dentro de las leguminosas de grano, el lupino constituye una interesante fuente proteica y energética en la producción avícola. La semilla de lupino presenta una composición considerable de proteínas, fluctuando el contenido de ella entre 30 y 45%, dependiendo del cultivo, selección genética y época del año (Mc Ginnis, 1990). Sin embargo, presenta deficiencia en aminoácidos azufrados, principalmente metionina (Mora, 1980). Por otra parte, posee un elevado valor de energía metabolizable, el cual varía entre 2.991 a 3.280 Kcal/kg en L. albus Mora, 1980).

El lupino presenta sustancias antinutricionales, entre las que se encuentran los taninos, inhibidores de proteasas, hemaglutininas, alfagalactósidos y alcaloides, encontrándose los tres primeros en muy baja cantidad (Tapia, 1982). Especial importancia tienen los alcaloides presentes en las distintas variedades de Lupinus spp., los cuales se clasifican dentro del grupo quinolizidínico. Los alcaloides se ubican mayoritariamente en la semilla, como son: lupanina, 13-hidroxilupanina, esparteína, 4-hidroxi-lupanina, multiflorina y angustifolina, siendo el primero el de mayor proporción (von Baer y col., 1992).

Los lupinos han sido clasificados, según el contenido de alcaloides, en “amargos” aquellos que poseen hasta un 3% y “dulces” aquellos que presentan un 0.05% von Baer y col., 1992).

El consumo de alcaloides del lupino se caracteriza por acción paralizante del sistema nervioso central, especialmente a nivel del centro respiratorio y vasomotor, los cuales son estimulados y luego paralizados. Este efecto origina fallas en la presión sanguínea, lenta frecuencia cardíaca, dilatación pupilar y muerte por asfixia asociada con convulsiones, cuadro conocido como “Intoxicación por lupino”, el cual se ha presentado en forma natural en caprinos, bovinos, ovinos, porcinos, equinos y ciervos (Jurado, 1989). Se describe, además, un cuadro teratogénico producido por uno de los alcaloides del lupino, la anagirina, presente en L. caudatus y L. sericus (Keeler y Gross, 1980). Por lo general los alcaloides son considerados hepatotóxicos (Jones y Hunt, 1983); sin embargo, estas sustancias quinolizidínicas no producen acciones nocivas sobre el hígado (Blood y col., 1988). No obstante, se describe un cuadro hepático de carácter crónico llamado “lupinosis”, el cual es producido por los metabolitos tóxicos del hongo Phomopsis leptostromiformis, parásito de la semilla (Culvenor y col., 1986).

Diferentes investigadores han utilizado lupino en raciones de ponedoras, llegando a incorporar hasta un 30% en la ración, sin observar diferencias productivas (Prinsloo y col., 1992).

El propósito del presente estudio fue evaluar la incorporación de lupino amargo en la ración de ponedoras, y determinar los posibles daños anatomopatológicos e histopatológicos a nivel hepático, renal y cerebral. Además, evaluar la funcionalidad hepática mediante estudio enzimático y la posible mortalidad.
 

MATERIAL Y METODOS

Se utilizaron 160 gallinas White Leghorn, línea Shaver Starcross 288 (Shaver, 1993), de 34 semanas de edad al inicio de la experiencia. Las aves fueron mantenidas en jaulas individuales, administrándoles 112.5 g de alimento/día/ave y agua a voluntad por 22 semanas. Durante todo el tiempo experimental se llevó control de luz, mediante reloj-control hasta completar 15 h/luz/día, cantidad de horas luz utilizada hasta el término de la experiencia.

Se trabajó con semilla de Lupinus albus variedad Multolupa tanto dulce como amarga, con un 10% de inclusión en las raciones, las cuales se componían de una dieta basal (maíz, afrechillo de trigo, harina de pescado, ácidos grasos, con-chuela, fosfato, metionina, vitaminas, minerales y sal). Las semillas dulce y amarga contenían 0.043% y 2.63%, respectivamente, de alcaloides totales, expresados como lupanina.

Se utilizaron 4 grupos de 40 aves cada uno, dependiendo de los niveles de inclusión de alcaloides en la ración:

Grupo A: Ración dulce (0.0105 g% de alcaloi-des).
Grupo B:  Ración semidulce (0.0421 g% de al-ca-loi-des).
Grupo C:  Ración semiamarga (0.106 g% de al-caloides).
Grupo D:  Ración amarga (0.148 g% de alcaloi-des).

VARIABLES ESTUDIADAS

1. Estudio enzimático: se midieron las enzimas Aspartato-aminotransferasa (AST) (EC¹ 2.6.1.1.), Alanino-aminotransferasa (ALT) (EC¹ 2.6.1.2.) y Fofatasa alcalina (FA) (EC¹ 3.1.3.1.). Se realizaron cinco muestreos a las semanas 4, 8, 12, 16 y 22 del período experimental, obteniéndose en cada muestreo sangre entera vía punción de la vena alar, al 10% de las aves de cada grupo.

2. Estudios macro y microscópico: se realizaron estudios anatomopatológicos e histopatoló-gicos del 5% de las aves al inicio de la experiencia (grupo control inicial) y del 20% de cada grupo al finalizar el estudio. El sacrificio de las aves se hizo por insensibilización a nivel de la articulación occipitoatlantoidea, con posterior sección de la vena yugular, obteniéndose muestras de hígado, riñón y cerebro, realizándose in situ el estudio macroscópico. Para el análisis microscópico se extrajeron muestras de dichos órganos y se fijaron en formalina tamponada al 10%; con posterioridad se procesaron en autotécnico y se incluyeron en parafina para ser cortadas a 5 micras de espesor y teñidas sólo con hematoxilina-eosina (Armed Forces Institute of Pathology, 1968). Para determinar la degeneración grasa se cuantificó indirectamente la presencia de vacuolas intracitoplasmáticas (degeneración vacuolar) por simple observación microscópica.

En el cuadro 1 se detallan las aves por grupo y muestreo para los estudios enzimáticos, macro y microscópicos.

3. Estudio de mortalidad: se llevó registro de mortalidad.

ANALISIS DE LABORATORIO

La actividad enzimática se determinó mediante método cinético UV a 30° C según IFCC y DGKC. Se utilizaron kits enzimáticos Boehrin-ger-Mannheim (AST: Nº 1.442.708; ALT: Nº 487.368 y FA: Nº 1.442.236), empleando un fotómetro Hitachi 4020.

Los niveles de alcaloides, tanto en la semilla como en las raciones, se determinaron con el mé-todo de cromatografía en capa fina, en el Depto. de Análisis Instrumental de la Fac. de Quí-mi-ca y Farmacia de la Universidad de Concepción.

Análisis estadístico: se practicó la prueba de X2 (ji cuadrado) de homogeneidad entre los grupos con un nivel de significación del 5% en el análisis de los trastornos macro y microscópicos al final de la experiencia y un análisis de varianza de dos vías para el estudio enzimático, empleándose el programa computacional Microstat versión 4.0 de 1984.
 

RESULTADOS

1. ESTUDIO ENZIMATICO

Aspartato-aminotransferasa: en la actividad de esta enzima no se encontraron diferencias significativas (p > 0.05) entre los 4 grupos como tampoco entre los muestreos realizados (cuadro 2).

Alanino-aminotransferasa: esta enzima evidenció diferencias significativas (p < 0.05) entre los grupos en estudio en el tercer muestreo y entre los muestreos realizados (cuadro 3).

Fosfatasa alcalina: la actividad observada en esta enzima evidenció diferencias significativas (p < 0.05) entre los distintos muestreos, no apreciándose diferencias entre los grupos alimenticios (cuadro 4).

2. ESTUDIOS MACRO Y MICROSCOPICOS

Análisis macroscópico: el examen macroscópi-co de hígado, cerebro y riñón al inicio de la experiencia no reveló lesiones. Sin embargo, al término de ésta en el hígado se observó el parénquima de textura friable en los 4 grupos analizados, evidenciándose de coloración amarillo-pálida con bordes redondeados y tumefactos, características que indicaban degeneración grasa, y además se evidenció congestión (cuadro 5), no encontrándose diferencias significativas (p > 0.05) entre los grupos. Por otra parte los riñones presentaron focos hemorrágicos en los grupos C y D y congestión en la totalidad de ellos, no observándose diferencias significativas (p > 0.05) entre los grupos (cuadro 6). En relación al cerebro, éste sólo evidenció edema en todos los grupos en estudio al final de la experiencia.

Análisis microscópico. Hígado: al inicio de la experiencia se evidenciaron trastornos degenerati-vos y necróticos de carácter leve. Por otra parte, al final del estudio, las alteraciones histopatoló-gicas encontradas en los hígados correspondieron a trastornos necróticos, degenerati-vos, circulatorios y del crecimiento celular, no observándose diferencias significativas (p > 0.05) entre los grupos (cuadro 7).

Riñón: al inicio de la experiencia, los riñones examinados presentaron trastornos inflamatorios, degenerativos, del crecimiento celular y necróticos. En el cuadro 8 se presentan las alteraciones histopatológicas de los riñones al finalizar el estudio; se pueden apreciar trastornos necró-ticos, inflamatorios y del crecimiento celular, no observándose diferencias significativas (p > 0.05) entre los grupos. Trastornos degenerativos focales de carácter vacuolar se observaron en los grupos B (lupino semidulce), C (lupino semiamar-go) y D (lupino amargo), apreciándose diferencias significativas (p < 0.05) entre el control y el resto de los grupos.

Cerebro: a nivel cerebral, al inicio de la experiencia, sólo se evidenció edema. En el cuadro 9 se presentan las alteraciones histopatológicas de los cerebros al final de la experiencia. En los grupos experimentales se observaron trastornos necróticos, degenerativos, circulatorios y del crecimiento celular a nivel de la sustancia gris del cerebro, no observándose diferencias significativas (p > 0.05) entre los grupos.

3. MORTALIDAD Y DESCARTE

En el transcurso del ensayo se observó una muerte súbita, producto de insuficiencia del músculo cardíaco en una gallina del grupo control. Además, se descartaron tres aves que presentaron el cuadro de “Fatiga de Jaula”, las cuales fueron sacrificadas.
 

DISCUSION

El estudio enzimático de la enzima AST no evidenció variaciones entre los grupos durante el tiempo de experimentación. En relación a valores de referencia normales, Fernández y col. (1994) describen un rango de 195 ± 34.7 UI/l en gallinas ponedoras (Hyssex-Brown) de 27 semanas de edad. Además, Altman (1979) señala que una actividad enzimática superior a 230 UI/l debe ser considerada elevada, y ser sospecha de compromiso hepatocelular. Comparando estos valores con los obtenidos en la presente investigación, se observa que la actividad de esta enzima se encuentra dentro de los rangos normales en todos los grupos y muestreos.

Los valores de referencia normales para la enzima ALT en gallinas ponedoras Hyssex-Brown de 27 semanas de edad descritos por Fernández y col. (1994) son del orden de 12.9 ± 5.2 UI/l. Por otra parte, esta enzima evidenció un aumento significativo en su actividad en el tercer muestreo, el cual se observó en todos los grupos, siendo mayor en el grupo con lupino semidulce. Este aumento, comparado con las otras enzimas analizadas en el mismo muestreo, demuestra que sólo ALT tuvo valores sobre los rangos normales, concluyendo que este aumento es inespecífico y no se relaciona con la cantidad de alcaloides en los distintos grupos.

Para FA se describen valores de normalidad en ponedoras durante su primera fase de postura de hasta 2.300 UI/l, valores sobre este límite son considerados anormales (Hung2). Los valores obtenidos muestran un aumento de actividad al inicio en los 4 grupos, descendiendo en los sucesivos muestreos, lo cual coincide con lo expresado por Bell (1960), quien señala que la actividad fosfatásica se eleva al comienzo de la postura, y después de 3 a 4 semanas, por la mayor demanda metabólica a que son sometidas las aves al inicio de la postura.

En relación a las lesiones macroscópicas observadas a nivel hepático, la friabilidad fue el trastorno más frecuente, asociándose con hepatosis grasa. Riddell (1987) señala que estas lesiones se observan principalmente en cuadros de hepatosis grasa, las cuales tienen su origen en procesos tóxicos, cuadros carenciales, afecciones hipóxicas o dietas hiperlipídicas. Por otra parte, las alteraciones macroscópicas diagnosticadas en la presente investigación no concuerdan con lo reportado por González (1990) en ponedoras White Leghorn alimentadas durante 7 días con lupino (1.57% alca-loi-des totales) en un 6% de la ración, quien encontró degeneración grasa más severa que la observada en el presente estudio. Además, él encontró coágulos en la superficie hepática producto de ruptura de la cápsula de Glisson, asociando este autor las lesiones a la acción de los alcaloides.

A nivel renal, las lesiones circulatorias no constituyen afecciones específicas que se relacionen con la acción tóxica de los alcaloides, ya que estas lesiones están presentes en procesos septicémicos, tóxicos e hipóxicos de diferentes etiologías (Jubb. y col., 1985).

El estudio macroscópico a nivel cerebral sólo evidenció edema.
El análisis histopatológico de los hígados, al inicio de la experiencia, permite deducir que las afecciones observadas se relacionan con la alimentación recibida, la cual es responsable de los trastornos necróticos y degenerativos presentes en las células hepáticas. Por otra parte, a las 56 semanas, los hígados evidenciaron principalmente trastornos degenerativos de carácter graso. Esta lesión, si bien es cierto representa un severo estado degenerativo en mamíferos, en gallinas ponedoras se considera normal, dado el fuerte estrés metabólico que les origina la postura (Riddell, 1987). Cabe destacar que si bien es cierto se observaron diferencias en el compromiso celular del parénquima hepático entre los grupos, éstas no fueron significativas, lo cual lleva a concluir que los hígados de las gallinas alimentadas con diferentes porcentajes de alcaloides en la dieta no evidenciaron alteraciones de importancia patológica producto de los niveles de alcaloides incorporados. Por otra parte, los resultados no concuerdan con lo reportado por Moreira (1982), quien describe lesiones hepáticas moderadas de carácter graso al incorporar semilla de Lupinus albus var. Multolupa hasta en un 12.5% de la ración en ponedoras, en un lapso de 76 semanas, concluyendo que mientras más prolongada es la ingestión de esta leguminosa, más severos son los trastornos degenerativos (degeneración grasa, amiloidosis) y del crecimiento celular (hiperplasia linfoide, megalocitosis, hipertrofia de las células de Küpfer) en el parénquima hepático.

Los hallazgos microscópicos renales al inicio de la experiencia se relacionan con el tipo de alimentación o con cuadros infecciosos subclínicos, los cuales son responsables de los trastornos observados en los túbulos y glomérulos. Por otra parte, al término de la experiencia, se evidenció un aumento de los trastornos degenerativos de tipo vacuolar en las células epiteliales tubulares de los grupos que recibieron mayores niveles de alcaloides en la dieta, los cuales, sin embargo, fueron de carácter leve. Estos trastornos se asocian con aspectos nutricionales, tóxicos, metabólicos e infecciosos (Riddell, 1987). En el presente caso, la degeneración vacuolar podría relacionarse con aspectos tóxicos de tipo crónico por parte de los alcaloides, ya que se sabe que éstos son removidos rápidamente de la circulación vía renal, aumentando así la función excretora del riñón, que explicaría la mayor actividad de las células epiteliales de los túbulos renales. En general, los alcaloides del lupino a nivel renal originaron trastornos degenerativos leves en los túbulos renales. Las otras alteraciones diagnosticadas no presentaron diferencias entre los grupos, de tal modo que se puede señalar que en los porcentajes de inclusión de lupino dulce, semidulce, semiamargo y amargo utilizados, y en el lapso de tiempo administrado, no originan alteraciones de importancia en los riñones atribuibles a la presencia de alcaloides en la dieta.

En el examen histopatológico de cerebro, al inicio de la experiencia, sólo se evidenció edema, producto del proceso mismo de eutanasia de las aves. Sin embargo, al final del estudio, lo más significativo lo constituyó, junto al edema, la presencia de degeneración neuronal, satelitosis, picnosis y proliferación de las células de la glía. Por otra parte, (Riddell, 1987) señala que se pueden encontrar lesiones degenerativas y proli-ferativas de carácter leve en aves adultas clíni-camente sanas.

De los resultados obtenidos, es importante señalar que si bien se observaron trastornos a nivel cerebral, éstos fueron de carácter leve, no apreciándose signología nerviosa en el transcurso de la experiencia. Se podría suponer que pequeñas cantidades de alcaloides en la dieta de las aves son suficientes para originar trastornos degenerativos y necróticos de carácter leve en el sistema nervioso central. A su vez, se puede inferir que dichas alteraciones no producen signología clínica, a diferencia de lo observado en los cuadros de “Intoxicación por lupino”, en que se produce un cuadro clínico que cursa con parálisis y muerte.

Si se analizan los porcentajes de mortalidad durante la experiencia, se descarta el posible efecto tóxico letal de los alcaloides en las concentraciones empleadas.

Finalmente, al analizar en conjunto los hallazgos encontrados, se evidencia que los valores enzimáticos de la funcionalidad hepática indican una actividad normal de los hepatocitos, lo cual se contrapone con los resultados del estudio histopatológico; sin embargo, esta condición se debe analizar con precaución, ya que los valores de referencia enzimáticos indicados por Fernández y col. (1994) y Altman (1979) son tomados de gallinas de la misma edad y función a las utilizadas en el presente estudio, y esta situación asociada a lo expresado por Riddell (1987) en que menciona que es normal encontrar trastornos degenerativos de carácter graso a nivel hepático en gallinas ponedoras durante su primera fase de postura, los hallazgos del presente estudio no indicaron un severo daño de los hepa-tocitos y, por ende, no se afectó la funcionalidad del hígado.

Al correlacionar los hallazgos histopatológicos observados en cerebro en los 4 grupos que recibieron distintos porcentajes de alcaloides con la mortalidad durante la experiencia, no se originó signología nerviosa ni causas de mortalidad que hicieran sospechar de una intoxicación atribuible a los alcaloides del lupino.

Semilla de lupino amargo conteniendo 2.63% de alcaloides totales, incorporada hasta en un 10% de la ración de gallinas ponedoras durante su primera fase de postura, no originó efectos nocivos en la salud, como lo demostró el análisis enzi-mático, macroscópico e histopatológico de hígado, riñón y cerebro.  

RESUMEN

Se estudió el efecto de la incorporación de semilla de Lupinus albus var. Multolupa en la ración de gallinas ponedoras.

Un total de 160 gallinas White Leghorn (línea Shaver Starcross 288), de 34 semanas de edad, divididas al azar en 4 grupos, fueron alimentadas en forma controlada durante 22 semanas con una dieta basal más un 10% de semilla de lupino con diferentes porcentajes de alcaloides.

Las aves fueron divididas en 4 grupos de 40 aves cada uno, a las que se les administró 0.0105, 0.0421, 0.106 y 0.148 g% de alcaloide, respectivamente.

El estudio enzimático consideró las enzimas as-partato-aminotransferasa, alanino-aminotrans-ferasa y fosfatasa alcalina. Se recolectaron muestras de hígado, cerebro y riñón para estudio macro y microscópico, y se llevó un registro de mortalidad.

No se encontraron valores enzimáticos que indiquen alteraciones a nivel hepático atribuibles al lupino. Las principales alteraciones morfoló-gicas encontradas fueron trastornos degenerativos y necróticos en cerebro, en igual proporción en los 4 grupos. A nivel renal, en los túbulos se observaron trastornos degenerativos de carácter vacuolar. Las lesiones encontradas en hígado no mostraron un claro compromiso de este órgano.

Se concluye que la semilla de lupino amargo con 2.63% de alcaloides, incorporada hasta en un 10% de la ración de ponedoras durante su primera fase de postura, no produce efectos nocivos en la salud de las aves.

Aceptado: 23.01.97.
* Proyecto FONDECYT Nº 1930371.

¹ Nombre formal de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica.
² Comunicación Personal. Dr. Armando Hung, 1994. Profesor de Patología Clínica, Universidad Mayor de Lima, Perú.

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